[发明专利]同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速同时检测食品中产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌活菌的方法。 

技术背景

蜡样芽孢杆菌是一种能产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛分布于空气、污水和各类生熟食品中。目前，从多种食品中分离出该菌，包括炒米饭、肉类、乳类和鱼等，是常见的食源性致病菌，极有可能危害人们的健康。在我国蜡样芽孢杆菌引起的中毒事件比较严重，在1993～2003十年间，蜡样芽孢杆菌中毒者高达1758人。蜡样芽孢杆菌引起的中毒症状主要有呕吐和腹泻，由肠毒素引起腹泻的食源性疾病研究较多，检测方法比较成熟并已经商业化，然而关于蜡样芽孢杆菌呕吐毒素的研究相对较少，但是呕吐型蜡样芽孢杆菌引发的食物中毒，尤其是米饭类的中毒事件时有发生。在美国，食用炒米饭发生中毒的主要原因是其中污染了产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌。目前，蜡样芽孢杆菌已被挪威和荷兰认定为食品中最容易检出的病源微生物。蜡样芽孢杆菌主要造成食物和饮水不卫生的人群中毒，其中使用受污染的食物是造成蜡样芽孢杆菌感染的主要途径。 

目前检测蜡样芽孢杆菌的方法主要是通过传统的培养方法。传统 方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点，且特异性差，易造成大量错误识别。因此快速、准确地检测蜡样芽孢杆菌的方法至关重要。 

蜡样芽孢杆菌的cesB是呕吐毒素合成酶结构基因的一个亚基，能够编码蜡样芽孢杆菌的呕吐毒素。本发明采用cesB作为靶基因设计引物进行检测，特异性强，能用于对蜡样芽孢杆菌进行准确检测。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能消除假阴性和假阳性且能同时检测产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的方法。该方法可用于食品样本中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的初筛检测，其操作快速、结果客观准确，避免了现有方法操作繁琐、费时费力和成本高昂的缺点。 

本发明是通过以下技术方案实现的。 

一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于含有引物分别为：从5’-3’为 

cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT 

cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC 

16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC 

16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG 

IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT 

IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC。 

所述的试剂盒还含有叠氮溴化丙锭PMA，PBS磷酸盐缓冲液，Taq mix。 

本发明涉及一种叠氮溴化丙锭处理结合多重PCR快速同时检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒的检测方法，包括如下步骤： 

（1）取食物样本，按质量体积比1:9加PBS缓冲液，充分混匀，离心，取上清得菌悬液； 

（2）取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL，混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA； 

（3）所得DNA进行mPCR，体系包含总共20μL反应液，其中，3μL制备的模板DNA溶液，10μL2×Taq mix，cesB引物的浓度是0.4μM，16S rRNA引物的浓度是0.1μM，扩增内标的浓度为0.25μM；反应条件是：95℃10min，接着40个循环（94℃30s，51℃30s，72℃30s），最后72℃延伸10min； 

（4）mPCR反应结束后，进行目的菌检测分析。 

步骤（1）所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。 

步骤（3）所述引物分别为：从5’-3’为 

cesB-F:ACCCATCTTGCGTCATT 

cesB-R:CAGCCAAGTGAAGAATACC 

16S-F:GCGGCGTGCCTAATACATGC 

16S-R:CTCAGGTCGGCTACGCATCG 

IAC-F:CCTACGGGAGGCAGCAGT 

IAC-R:CGTTTACGGCGTGGACTAC