[发明专利]同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于含有引物分别为：从5’-3’为

cesB-F: ACCCATCTTGCGTCATT

cesB-R: CAGCCAAGTGAAGAATACC

16S-F: GCGGCGTGCCTAATACATGC

16S-R: CTCAGGTCGGCTACGCATCG

IAC-F: CCTACGGGAGGCAGCAGT

IAC-R: CGTTTACGGCGTGGACTAC 。

2.根据权利要求1所述的一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的试剂盒，其特征在于还含有叠氮溴化丙锭PMA，PBS磷酸盐缓冲液，Taqmix。

3.根据权利要求1或2所述的一种同时快速准确检测食品中活的产呕吐毒素和不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌试剂盒的检测方法，其特征在于包含下列步骤：

（1）取食物样本，以按质量体积比1: 9加无菌缓冲液，充分混匀，离心，取上清得菌悬液；

（2）取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙锭溶液，使叠氮溴化丙锭PMA的终质量浓度为5 μg/mL，混匀后室温避光5 min，每隔30 s摇匀一次，曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；

（3）所得DNA进行mPCR，体系包含总共20 μL反应液，其中，3 μL 制备的模板DNA溶液，10 μL 2 × Taqmix，cesB引物的浓度是0.4 μM，16S rRNA引物的浓度是0.1 μM，扩增内标的浓度为0.25 μM;反应条件是：95 ℃ 10 min，接着40个循环（94℃ 30 s， 51℃ 30 s，72℃ 30 s），最后 72℃ 延伸10 min；

（4）mPCR 反应结束后，进行目的菌检测分析。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（1）所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有475 bp条带，则指示反应体系正常；若没有出现475 bp条带，则反应体系有PCR抑制剂或者PCR操作出现错误，需要重新进行PCR；

扩增产物有475 bp条带的前提下，若有267 bp条带和154 bp条带，则说明有产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌；若仅有267 bp条带，则说明有不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌。