[发明专利]合成四环素偶联抗原的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种合成四环素偶联抗原的方法。

背景技术                             

自1948年问世以来，四环素陆续被应用于临床，并已成为应用最多，最广泛的广谱抗菌素了。现在已有大量资料证实，长期反复使用四环素，可影响牙齿的发育和形成，不但使牙齿变黄，还会引起牙釉质发育不良或牙齿畸形。四环素可致肝毒性，通常为脂肪肝变性，妊娠期妇女、原有肾功能损害的患者易发生肝毒性。四环素可引起变态反应：多为斑丘疹和红斑，少数患者可出现荨麻疹、血管神经性水肿、过敏性紫癜、心包炎以及系统性红斑狼疮皮疹加重。为了控制四环素类药物在动物性食品中的残留，欧盟、美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物最大残留限量为0.1mg/Kg。

目前快速检测动物性食品中四环素的残留多采用灵敏度高，检测时间短的免疫检测技术，这项技术的核心原料之一是四环素偶联抗原，四环素偶联抗原的合成方法报道的很多，但是目前存在合成率低，效价低的现象，必然使检测四环素残留的研发生产和销售成本价格偏高。

CN1861631公开了《四环素的偶联物及其制备方法与应用》，该方法的步骤是：将四环素与1-1’-羰基二咪唑（CDI）按摩尔比为1：1-1：3的比例溶在无水丙酮中，通入氮气，在氮气的保护下，37℃下避光反应2-4小时，反应生成四环素与1-1’-羰基二咪唑的活性中间体，备用；同时，以四环素与牛血清蛋白的摩尔数比为20：1-35：1的量，称取牛血清蛋白备用；将上述反应后的溶液A中的丙酮旋转蒸干，加入pH=8.5±0.5，浓度为0.5M的硼砂缓冲溶液生成的四环素与1-1’羰基二咪唑的活性中间体，然后再加入上述的牛血清蛋白，使牛血清蛋白的终浓度为10±5mg/ml，在氮气的保护下，20-30 ℃避光反应30-48小时，得溶液B；用pH7.3-7.5，浓度为0.01-0.02M的磷酸缓冲液在0-4℃下，搅拌透析溶液70-80小时，然后改用蒸馏水透析20-30小时，每6小时更换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到淡黄色的四环素的偶联物。以上方法的缺点是：合成过程中需要通入氮气保护，增加了合成成本及方法的繁琐性；合成时间长，最短需要122个小时。因此需要针对上述的方法进行改进，探索一种低成本的、能快速合成四环素偶联抗原的方法。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种低成本的、快速的合成四环素偶联抗原的方法。

本发明是通过下述的技术方案来实现的：

合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：

a. 四环素的衍生化

 称取四环素，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；

称取N，N-羰基二咪唑，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；

将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于34-39℃下搅拌衍生1-5小时；

b. 四环素与蛋白偶联

称取牛血清白蛋白，加入PBS溶解，得到溶液③，将步骤a中衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于34-39℃搅拌反应3-8小时，然后4℃放置过夜；所述的放置过夜是指放置8-14小时；

c. 偶联抗原的纯化

 将步骤b中偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃下放置，用蒸馏水透析1-3天，每隔4-8小时换蒸馏水一次；

d. 偶联抗原的鉴定

采用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释，所述的稀释倍数为1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。

优选的，合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：

a.  四环素的衍生化

 称取四环素2mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；

称取N，N-羰基二咪唑30mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；

将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于37℃中搅拌衍生3小时；

b.  四环素与蛋白偶联

 称取牛血清白蛋白10mg，加入600μL 0.01M PBS溶解，得到溶液③，将步骤a中衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于37℃搅拌反应5小时，然后4℃放置过夜；所述的放置过夜是指放置8-14小时；

c.  偶联抗原的纯化