[发明专利]一种纯化DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纯化DNA的方法。

背景技术

目前国内开发的核酸类产品以保健品为主，但颇受争议。大连珍奥核酸（CN1169434），为由豆类提取的小分子核酸（DNA+RNA），辅以维生素、微量元素。安泰核酸（CN1225210），为以猪胰脏酶解制成的小分子DNA及肽类的混合物。正分子核酸，为鲑鱼精DNA，辅以花粉、维生素。日本在核酸功能性食品方面的研发则更为活跃。核酸作为营养保健食品的生产用原料，对纯度要求并不高，目前采用的制备方法多以生物酶解、物理、化学方法为主。

针对多个药物靶点筛选的核酸适体药物已被FDA批准上市。欧美的研究重点集中在采用生化方法制备核酸及其降解产物上：15,000-30,000Da的单链寡DNA（去纤苷）在溶血及内皮细胞保护上表现出了广阔的开发前景，针对肝小静脉闭塞症的临床试验已经开展到Ⅲ期；4,000-10,000Da的单链寡DNA表现了良好的局部抗缺血活性（CN1073448）；最近的研究表明4,000-10,000Da的单链寡DNA和去纤苷在抗恶性肿瘤血管新生方面极具开发潜力，辅助治疗多发性骨髓瘤已进行到Ⅱ期临床试验。这类寡脱氧核苷酸药用分子多采用注射给药，制备原料为动物组织及脏器来源的DNA，对蛋白质残留及分子量分布有较严格的要求。分子量分布在1500-550,000Da的动物来源DNA钠盐的等张溶液可以作为血浆代用品，要求异源蛋白质残留少于1.5%，用于治疗人体严重的急性和慢性损伤，并具有免疫调节作用。哺乳动物脏器提取RNA生产注射剂可用于恶性肿瘤、重症肝炎的辅助治疗。动物脏器经组织匀浆粗提后，为保证蛋白质的去除效果，一般需经苯酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂抽提，毒性较大且不易去除，难以保证终产品安全性。酚仿抽提是分子生物学实验中提纯DNA的主要方法，但并不适用于大规模纯化药用级DNA。工业生产中大规模抽提DNA的通常步骤为：细胞组织匀浆后，用1mol/L氯化钠高盐提取核蛋白、通过碱裂解、生物酶解去杂蛋白，制备的DNA产品可满足保健食品的质量需求，但仍残留有微量杂蛋白及小分子寡核苷酸，不能直接用于制备寡核苷酸药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化DNA的方法。

本发明提供了一种从粗品DNA中精制DNA的方法，包括如下步骤：

（1）取粗品DNA，用水溶解并调pH至2.5-5.0，得到质量百分含量为0.5-6.0g/100mL的DNA溶液；

（2）将步骤（1）得到的DNA溶液上样于阳离子交换树脂柱并收集流出液；

（3）取步骤（2）得到的流出液，加入无机钠盐并使其浓度为0.5-1.5mol/L，调pH至6.5-7.5；

（4）取步骤（3）得到的溶液，加入等体积的无水乙醇以沉淀DNA；

（5）将步骤（4）得到的DNA沉淀烘干，然后用水溶解，得到质量百分含量为1.0-6.0g/100mL的DNA溶液；

（6）将步骤（5）得到的DNA溶液进行干燥，得到DNA精制品（药用级DNA产品）。

所述步骤（1）中，可采用40-70℃（如60℃）搅拌的方式促进粗品DNA的溶解。所述步骤（1）中，具体可用0.5mol/L HCl水溶液调节pH。所述步骤（1）中，所述pH具体可为3.0。所述步骤（1）中具体可将60g粗品DNA用1L去离子水溶解。市售粗品DNA多提取自动物脏器，组织匀浆后，高盐提取、碱裂解等物理、化学方法及生物酶解法虽可以保证去除大多数蛋白质，但仍残留有少量蛋白，尤其是与DNA结合的富含碱性氨基酸的组蛋白及其降解产物。绝大多数蛋白质等电点均高于4.0，调节pH值至3.0，一方面可保证杂蛋白带正电荷，另一方面可保证DNA的稳定性。