[发明专利]一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法

权利要求书

1.一种用于美容保养的成纤维细胞液及其制备方法，其特征在于，该成纤维细胞液含有细胞培养液、胶原蛋白、细胞生长因子、氨基酸和维生素；制备成纤维细胞液的方法采用成纤维细胞培养基培养脐带组织真皮细胞得到细胞培养液，再向细胞培养液的上清液中加入医用甘油和细胞因子制得成纤维细胞液。

2.一种制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，该方法的步骤包括获取脐带组织真皮细胞、原代培养脐带真皮组织细胞、传代培养脐带组织真皮细胞、收集细胞培养液、加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液。

3.如权利要求2所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，该方法的步骤为：

①获取脐带组织真皮细胞：用含有青链霉素的磷酸盐缓冲液冲洗脐带组织3次，将脐带组织剪成小块后真皮面朝下平铺于平皿中，向平皿中加入中性蛋白酶Ⅱ过夜培养；过夜后分离表皮与真皮，将真皮剪成小块接种于含有成纤维细胞培养基的培养皿中得到脐带组织真皮细胞；

②原代培养脐带组织真皮细胞：将得到的脐带组织真皮细胞进行原代培养，每三天更换一次成纤维细胞培养液；

③传代培养脐带组织真皮细胞：用酶解液消化原代培养的脐带组织真皮细胞，酶解完成后加入成纤维细胞培养基终止酶解，再用吸管吹打细胞，然后按照1:3的比例进行传代培养；

④收集细胞培养液：将传代至4~6代的培养皿中的细胞上清液收集起来得到细胞培养液；

⑤加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液：向细胞培养液中加入医用甘油和细胞因子制得成纤维细胞液。

4.如权利要求3所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，第一步中将真皮剪成0.5~1mm³的小块；第一步中过夜培养的条件为4℃过夜培养。

5.如权利要求4所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，第二步中原代培养脐带组织真皮细胞的条件为，向培养皿中加入0.5ml成纤维细胞培养基于37℃恒温培养，二氧化碳气体的体积分数为5%。

6.如权利要求5所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，第三步传代培养脐带组织真皮细胞的操作中，酶解液为含有质量分数为0.25%的胰酶和质量分数为0.02%的乙二胺四乙酸的酶解液，酶解时间为1分钟。

7.如权利要求6所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，第五步加入甘油和细胞因子制得成纤维细胞液步骤中，每500ml细胞培养液中加入300g医用甘油，向细胞培养液中加入的细胞因子包括：成纤维细胞生长因子0.25~0.45 mg/L、表皮细胞生长因子2.5~4 mg/L、I型胶原蛋白0.5~3 mg/L、肝细胞生长因子0.5~3 mg/L、角质细胞生长因子3~6 mg/L、γ-氨基丁酸2~8.5 mg/L、维生素b12为0.3~1 mg/L。

8.如权利要求7所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，该方法制得的成纤维细胞液中细胞因子的含量为：成纤维细胞生长因子0.32 mg/L、表皮细胞生长因子3.35 mg/L、I型胶原蛋白1.71 mg/L、肝细胞生长因子1.71 mg/L、角质细胞生长因子4.31 mg/L、γ-氨基丁酸4.45 mg/L、维生素b12为0.68 mg/L。

9.如权利要求8所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，第三步中传代培养脐带组织真皮细胞的时间为15～25天。

10.如权利要求9所述的制备用于美容保养的成纤维细胞液的方法，其特征在于，成纤维细胞培养基采用美国coming cellgro公司的成纤维细胞培养基，该培养基缓冲体系为4-羟乙基哌嗪乙磺酸和重碳酸盐，成纤维细胞培养基成分为：500 ml基础培养基，10ml胎牛血清，5ml成纤维细胞生长添加物和5 ml青霉素与链霉素溶液。