[发明专利]一种体外诱导脂肪源性干细胞分化为雪旺细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诱导脂肪源性干细胞分化为雪旺细胞的方法，属于生物医学工程领域。

背景技术

雪旺细胞是外周神经的主要结构和功能细胞，在外周神经的发育和再生过程中发挥关键作用。研究表明，在外周神经多种移植体内加入雪旺细胞可促进轴突再生，但是由于雪旺细胞体外增殖能力差，难以获得足够数量，且自体移植又需要损伤正常神经组织，这些弊端成为了雪旺细胞作为移植用种子细胞的障碍。

脂肪源性干细胞是来源于脂肪组织的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，因其具有来源广泛、取材方便、体外增殖能力强等优点，越来越受到研究者的关注。文献报道，脂肪源性干细胞经体外诱导后能定向分化成雪旺细胞，分化后的雪旺细胞能促进神经元的轴突生长，且新生长的轴突具备兴奋传递的功能。有些研究者近年来已将脂肪源性干细胞复合脱细胞支架用于大鼠周围神经损伤修复的研究中，并取得了较为理想的效果。目前，脂肪源性干细胞分化为雪旺细胞常采用化学法和与雪旺细胞共培养法来实现。虽然诱导效果已得到许多实验室的证实，但是这两种方法都存在一定的弊端。化学诱导法需要在常规培养基中添加佛丝扣林、胰岛素、丁羟基茴香醚、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子等多种活性成分，诱导成本非常昂贵，而且为了达到更好的效果甚至需要预诱导，程序繁琐。共培养法是利用插入式培养皿将雪旺细胞饲养在上层，脂肪源性干细胞饲养在下层，两层细胞共用一个培养基，但是雪旺细胞在体外很难培养，常常受到成纤维细胞的污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外诱导脂肪源性干细胞分化为雪旺细胞的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种体外诱导脂肪源性干细胞分化为雪旺细胞的方法，包括以下步骤：

1）体外分离脂肪源性干细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；

2）取传代至第3-5代的脂肪源性干细胞，消化，收集细胞；

3）将收集的细胞放入含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，待其长至70-80%融合时，加入外周神经浸出液诱导；

4）诱导1-5d，脂肪源性干细胞分化为雪旺细胞。

所述外周神经浸出液的制备方法包括以下步骤：

取3-4周龄大鼠坐骨神经，剪碎成1-3cm的碎片，放入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在﹣20-4℃条件下保存2-5d，过40-200μm细胞滤网，所得滤液即为外周神经浸出液。

所述外周神经浸出液的加入量为每75cm²细胞生长面积加入8-12mL外周神经浸出液。

本发明的消化为常规方法，即用胰酶-EDTA消化。本发明的胰酶-EDTA是将0.25g胰酶和0.02g EDTA溶解于100ml PBS中，过滤后使用。

本发明的外周神经浸出液临用前用0.22μm滤膜过滤除菌。

本发明利用与雪旺细胞共培养的原理，直接利用外周神经浸出液来诱导脂肪源性干细胞向雪旺细胞分化，24h后可见大鼠脂肪源性干细胞由原来的扁平单层变化为具有双极的纺锤形，这些纺锤形的细胞继续增殖，细胞的密度会进一步提高。通过免疫荧光和Western-blot可充分证明，分化后的脂肪源性干细胞GFAP和S-100蛋白阳性表达。所有这些特性与雪旺细胞相同。可见，通过本发明的方法能将脂肪源性干细胞有效诱导成雪旺细胞。

化学诱导方法需要加多种生长因子，造价非常昂贵；共培养诱导需要先培养出雪旺细胞，而雪旺细胞的培养很容易受到成纤维细胞的污染，且这两种方法都约需要8d左右的时间才能见到GFAP和S-100的阳性表达。本发明所采用的方法不仅节约了诱导成本，缩短了诱导时间；且方法简便，不需再原代培养雪旺细胞。因此本发明诱导脂肪源性干细胞向雪旺细胞分化的方法，是一种可以取代化学诱导和共培养诱导的新方法。

附图说明

图1是实施例1的诱导前的大鼠脂肪源性干细胞诱导前倒置显微镜放大100倍的图片；

图2是实施例1的向雪旺细胞诱导分化后的大鼠脂肪源性干细胞倒置显微镜放大200倍的图片；

图3是实施例1的向雪旺细胞诱导分化后的大鼠脂肪源性干细胞GFAP免疫荧光染色；

图4是实施例1的向雪旺细胞诱导分化后大鼠脂肪源性干细胞的S-100免疫荧光染色；

图5是实施例1的向雪旺细胞诱导前和诱导分化后的大鼠脂肪源性干细胞的GFAP和S-100蛋白的Western Blot结果比较图；