[发明专利]一种定向筛选同源重组PGC的载体及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于鱼类生物工程技术领域，本发明涉及一种定向筛选同源重组PGC的载体，还涉该载体的制备方法，还涉及该载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用，本发明的定向筛选同源重组PGC的载体可以高效地利用同源重组技术制备带有特定遗传修饰的斑马鱼品系。 

背景技术

同源重组技术是构建基因敲除小鼠模型最普遍使用的方法，其基本步骤是：首先将打靶载体转入小鼠胚胎干细胞中；再通过合适的筛选系统鉴定出发生了同源重组的胚胎干细胞；然后通过嵌合体技术将遗传修饰过的胚胎干细胞培养成小鼠个体，从而制备出带有特定基因失活或者缺失的小鼠(Schafer,C.(2007).“Nobel Prize in medicine.Knockout mice revolutionize genetics”.Unfallchirurg.110,1082-1084.)。因此，同源重组技术和胚胎干细胞技术为小鼠中进行基因敲除奠定了基础。然而，在鱼类中，尽管同源重组事件也同样存在，由于尚没有建立把体外培养的细胞株转变成为个体鱼的技术，但是利用同源重组进行基因打靶的研究并不多（Liu,J.,Gong,L.,Chang,C.,Liu,C.,Peng,J.and Chen,J.(2012)Development of novel visual-plus quantitative analysis systems for studying DNA double-strand break repairs in zebrafish.J Genet Genomics39,489-502）。 

值得注意的，在小鼠中的嵌合体技术中，移植的胚胎干细胞只有发育为生殖细胞才能将遗传修饰传递下去，所以胚胎干细胞和嵌合体技术的最终目标是希望将遗传修饰作用到生殖细胞基因中。斑马鱼鱼具有产卵量大的优势，如果直接将斑马鱼的PGC作为基因打靶的对象，PGC是将来要发育为生殖细胞的胚胎细胞，筛选出PGC打靶成功的胚胎就能成功地将遗传修饰传递下去。 

但是，由于同源重组在动物中发生率只有10^-2～10^-5，如何筛选出发生了同源重组的细胞非常重要。在小鼠中应用最多的是正负筛选法，比如常用药物G418筛选所有能表达正筛选基因neo的细胞，然后用Ganciclovir淘汰表达单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSV-TK）的细胞，剩下的细胞为发生了同源重组的细胞。然而，基于药物G418和Ganciclovir的正负筛选系统却不能在斑马鱼胚胎中使用。由于没有合适的筛选系统，Zu等人利用同源重组在斑马鱼中进行基因打靶，结 果经过了繁重的筛选工作才筛选出能够将发生了同源重组传递下去的斑马鱼(Zu,Y.,Tong,X.,Wang,Z.,Liu,D.,Pan,R.,Li,Z.,Hu,Y.,Luo,Z.,Huang,P.,Wu,Q.,Zhu,Z.,Zhang,B.and Lin,S.(2013)TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.Nat Methods.10,329-331.)。因此，为了能够在斑马鱼中实现基因打靶并在细胞水平上对胚胎进行早期筛选，有必要在生殖细胞中建立高效的正筛选系统。