[发明专利]一种定向筛选同源重组PGC的载体及构建方法和应用

权利要求书

1.一种人工合成的载体，其特征在于载体p(UAS:mRFP, UAS:puma)，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述载体的制备方法，其步骤是：

（1）构建UAS驱动mRFP表达的正筛选载体p(UAS:mRFP)：

分别以质粒pBK-kalTA4和PCS2-mRFP为模板，UAS-mRFP-F和UAS-mRFP-m-R，UAS-mRFP-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和mRFP全长编码序列连接成一条DNA链UAS:mRFP；扩增条件为：95°C预变性4分钟；95°C变性30秒，62-58°C（每个循环降0.5°C）复性30秒，68°C延伸60秒，8个循环；95°C变性30秒，63°C复性30秒，68°C延伸60秒，15个循环；68°C延伸10分钟；4°C保存；再分别以UAS:mRFP和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，loxp66-4UAS-F和mRFP-nos1-m-F，mRFP-nos1-m-R和loxp71-4UAS-R为引物，运用连接PCR将UAS:mRFP和nanos1 3’UTR连接成一条DNA链UAS:mRFP-UTRnos1；扩增条件为：95°C预变性4分钟；95°C变性30秒，61-57°C，每个循环降0.5°C，复性30秒，68°C延伸90秒，8个循环；95°C变性30秒，62°C复性30秒，68°C延伸90秒，20个循环；68°C延伸10分钟；4°C保存；再将片段UAS:mRFP-UTRnos1连入pMD-18T载体中，获得载体p(UAS:mRFP)；

（2）构建UAS驱动mRFP表达串联UAS驱动促凋亡基因puma表达的正负筛选载体p(UAS:mRFP, UAS:puma)：

分别以质粒pBK-kalTA4和zPuma为模板，UAS-mRFP-F和UAS-puma-m-R，UAS-puma-m-F和UAS-mRFP-R为引物，运用连接PCR将UAS和puma全长编码序列连接成一条DNA链UAS:puma；扩增条件为：95°C预变性4分钟；95°C变性30秒，61-57°C，每个循环降0.5°C；复性30秒，68°C延伸50秒，8个循环；95°C变性30秒，62°C复性30秒，68°C延伸50秒，15个循环；68°C延伸10分钟；4°C保存；再分别以UAS:puma和质粒kop-new-F-EGFP-UTRnos1为模板，4UAS-puma-F-NdeI和UASpuma-nos-m-R，UASpuma-nos-m-F和4UAS-puma-R-HindIII为引物，运用连接PCR将UAS:puma和nanos1 3’UTR连接成一条DNA链UAS:puma-UTRnos1表达框；扩增条件为：95°C预变性4分钟；95°C变性30秒，61-57°C，每个循环降0.5°C，复性30秒，68°C延伸80秒，10个循环；95°C变性30秒，62°C复性30秒，68°C延伸80秒，20个循环；68°C延伸10分钟；4°C保存；再用NdeI和HindIII酶切连接的方法将UAS:puma-UTRnos1表达框连入载体p(UAS:mRFP)，获得p(UAS:mRFP, UAS:puma)载体。

3.权利要求1所述载体在定向筛选斑马鱼同源重组PGC中的应用。