[发明专利]3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种特异性3’-核苷酸酶。

背景技术

硫作为构成生命体的大量元素之一，是生命活动的必需元素。硫酸根离子通过膜转运蛋白进入细胞后，在ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase，ATPS）的催化下接受ATP的腺苷一磷酸基团形成腺苷-5’-磷酰硫酸（adenosine 5’-phosphosulfate，APS）。APS的3’羟基可被APS激酶（APS kinase，APSK）磷酸化形成3’-磷酸-腺苷-5’-磷酰硫酸（3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate, PAPS），PAPS可被PAPS还原酶等还原，最后整合到半胱氨酸及其它还原性硫化合物中（Leyh, TS，Crit Rev Biochem Mol Biol，1993，28, 515-42；王艳兴等，生命的化学，2011，31(2): 252-257），也可作为硫酸转移酶（sulfotranferase，ST）的底物进行硫酸化反应，参与化合物的生理功能调节及蛋白之间的互作（Leyh, TS，Crit Rev Biochem Mol Biol，1993，28, 515-42；Liu等，IUBMB Life，2007，59(10): 622-627）（表1）。

3’，5’二磷酸腺苷（3’-phosphoadenosine 5’-phosphate，PAP）在细胞内是硫代谢的中间代谢物之一（Leyh, TS，Crit Rev Biochem Mol Biol，1993，28, 515-42），如PAPS还原酶催化PAPS的还原生成PAP和亚硫酸盐；硫酸转移酶催化来自3’-磷酸-腺苷-5’-磷酰硫酸（3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate，PAPS）的活化硫酸根转移至其他化合物生成PAP；此外，非酶催化的3’-磷酸-腺苷-5’-磷酰硒酸（3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate，PAPSe）的水解也产生PAP（Yu 等， Arch Biochem Biophys 1989，269： 156-174； Hanna 等，2004，J Biol Chem 279, 4415-4424）。PAP在细胞内，可受到3’，5’二磷酸核苷酸酶（3’，5’-bisphosphate nucleotidase，ND）（Murguia等，J Biol Chem 1996，271(46): 29029-29033；Murguia等，Science 1995，267(5195): 232-234；Albert等，J Mol Biol 2000，295(4): 927-938.）催化3’-磷酸基团的水解产生5’单磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP），其K_m为0.7~17 μM （Albert 等，J Mol Biol 2000，295(4): 927-938；Spiegelberg等，J Biol Chem 1999，274(19): 13619-13628；Aggarwal 等，Arch Biochem Biophys 2008，469(2): 174-183）。AMP可经肌激酶（myokinase，MK）磷酸化生成5’二磷酸腺苷（adenosine 5’-diphosphate，ADP）以及丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）的进一步磷酸化生成ATP（表1）。研究表明酵母ND（yeast 3’，5’-bisphosphate nucleotidase，YND）亦可水解PAPS生成腺苷-5’-磷酰硫酸（adenosine 5’-phosphosulfate，APS）和磷酸（Spiegelberg等，J Biol Chem 1999，274(19): 13619-13628）。ND活性降低引起胞内PAP累积（Murguia等，J Biol Chem 1996，271(46): 29029-29033；Murguia 等，Science 1995，267(5195): 232-234；Albert 等，J Mol Biol 2000，295(4): 927-938；Spiegelberg 等，J Biol Chem 1999，274(19): 13619-13628；Mechold 等，Nucleic Acids Res 2006，34(8): 2364-2373），可影响硫酸转移酶（sulfotransferase，ST）（Whittemore等，Biochemistry 1985，24(10): 2477-2482；Ramaswamy等，J Biol Chem 1987，262(21): 10044-10047）, 酰基载体蛋白合酶（Yang等，Eur J Biochem 1994，224(2): 743-750）以及RNA加工酶（Dichtl等，EMBO J 1997，16(23): 7184-7195；Mechold等，Nucleic Acids Res 2006，34(8): 2364-2373）的活性，影响细胞的生长发育。