[发明专利]3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶及其构建方法和应用

权利要求书

1.3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶，其为以下（a）或（b）的蛋白质：

（a）由SEQ ID：NO.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）在（a）的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶活性的由（a）衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶，其特征在于：（b）的氨基酸序列为SEQ ID：NO.6 、SEQ ID：NO.7或SEQ ID：NO.8所示。

3.编码权利要求1或2所述的蛋白质的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列为SEQ ID：NO.1、SEQ ID：NO.2 、SEQ ID：NO.3或SEQ ID：NO.4所示的DNA分子。

5.一种构建权利要求1所述的3’，5’-二磷酸腺苷酸特异性3’-核苷酸酶的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）PCR法克隆的YND核苷酸序列和pET24a原核蛋白超表达载体，分别经限制性内切酶Nde I/Hind III双酶切后，利用T4连接酶连接构建表达载体pYND，用于表达YND；

2）利用PCR突变的方法获得DNA：根据YND基因的序列与所要突变的位点，设计定点突变PCR引物，以突变位点为中心，左右各取10-15个碱基，引物长度为25-45个碱基；

3)所获DNA转化E. coli DH5α 感受态细胞扩增质粒并测序验证；

4)将突变质粒转化E. coli BL21，接种过夜培养的菌液于液体培养基中培养,收集菌体；

5）取裂解液，悬浮菌体，混合均匀后，冰浴超声波破碎菌体，离心收集上清；

6）利用PAP琼脂糖凝胶纯化YND及其突变蛋白。

6.根据权利要求5所示的构建方法，其特征在于突变PCR引物的序列如下：

引物名称 引物序列（5’-3’）

G236A1:CATGATTACTTTAGAGGCAGTTGAAAAGGGACACTC

G236A2:GAGTGTCCCTTTTCAACTGCCTCTAAAGTAATCATG

G236C1:CATGATTACTTTAGAGTGCGTTGAAAAGGGACACTC

G236C2:GAGTGTCCCTTTTCAACGCACTCTAAAGTAATCATG

G236V1:CATGATTACTTTAGAGGTCGTTGAAAAGGGACACTC

G236V2:GAGTGTCCCTTTTCAACGACCTCTAAAGTAATCATG

G236S1:CATGATTACTTTAGAGAGCGTTGAAAAGGGACACTC

G236S2:GAGTGTCCCTTTTCAACGCTCTCTAAAGTAATCATG。

7.权利要求1或2所述特异性3’-核苷酸酶的应用，其特征在于：所述的特异性3’-核苷酸酶用于3’，5’二磷酸腺苷的检测。