[发明专利]一种用于检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种应用高分辨定量多色荧光原位杂交，检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，尤其是用于检测亚克隆间的进化关系及在化疗药物的作用下优势克隆的演变及亚克隆的消长。本发明提供的组合探针信号强度高，稳定性强，在Chroma公司的DAPI(SP-100),Spectrum Green^TM(MF101),Cy3^TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司的Cy5（50），PF-415(45)六种滤光片通道下无信号交叉，可以在单细胞水平同时定性定量检测5个目的基因的改变情况。可以用于检测目的基因拷贝数的改变、肿瘤异质性及亚克隆演变，检测肿瘤细胞基因组的不稳定性和复杂程度。为临床制定特异性的靶向治疗方案具有重要的指导意义。

背景技术

急性髓系白血病是一种克隆性异质性疾病，它的发生是一个多步骤的发病过程，累积多个基因，涉及多种遗传学异常。正常造血干祖细胞在致癌物质的作用下获得选择性的增殖优势，转化为前癌细胞。前癌细胞基因组不稳定，在增殖过程中不断获得遗传学损伤形成不同的变异体。在生存空间有限、营养物质缺乏、缺氧及最重要的在免疫杀伤的作用下，并非所有的亚克隆均能存活，直至出现的变异体能够突破上述进化屏障，这一变异体即为白血病起始细胞。白血病起始细胞克隆性增殖最终导致临床发病。虽然白血病细胞群全都来自白血病起始细胞，但是从生物学发病到临床发病的过程中，白血病起始细胞克隆性增殖的同时不断累积新的遗传学损伤形成一个异质性群体，亚克隆间的生长速度、侵袭能力及对药物的敏感性不同。其中比例最高的亚群称为优势亚克隆，优势亚克隆的生物学特性和白血病的临床表现相关。同一肿瘤患者体内可以存在有很多不同亚克隆细胞群，同一类肿瘤可以有不同的亚型，同一亚型的患者预后不同。单就急性白血病而言，其异质性存在的证据表现为：细胞形态学和免疫表型的多样性，细胞遗传学和分子生物学的异常。正是由于异质性的存在，使得肿瘤在治疗过程中逐渐表现出耐药、复发和侵袭力改变等行为。因此，在临床上研究肿瘤的异质性及亚克隆分群对肿瘤的靶向治疗具有重要意义。

目前，常用的检测异质性的方法具有两大类：一类是临床上治疗相关的检测指标：染色体核型分析、免疫表型、分子生物学检测等；另一类是近几年新近崛起的测序技术。但是目前应用的临床指标，在检测肿瘤细胞异质性上分辨率太低。以染色体核型分析为例：虽然可检测单细胞水平上多种基因组异常并列存在的情况，但分辨率太低（大约10Mb），只能检测大片段的缺失、扩增、异位等，而且染色体核型分析只能检测处于有丝分裂中期的细胞，计数的细胞少，只能反映增殖活跃细胞的遗传学改变；而测序技术虽然分辨率非常高，能获得海量的基因组异常信息也能观察到优势突变的演变，但是也只能从整体水平上反应异质性的存在及演变，不能分析多种基因异常在同一细胞水平同时存在的情况。

本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，应用高分辨定量多色荧光原位杂交，克服了以上两种方法的不足，兼顾了以上两者的优势，不仅分辨率较高，可以检测到隐匿性的基因异位、缺失和基因扩增，而且可在单细胞水平同时检测多个基因的异变。从而直观的分析肿瘤的异质性，亚克隆间的进化关系及优势克隆的演变。

发明内容

本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，可用于高分辨定量多色荧光原位杂交，检测单细胞水平上多种基因异常并列出现的情况，从而将个体细胞进行不同的亚克隆分群，本方法适用于大规模的临床研究并对靶向治疗具有重要的指导意义。

本发明的一个目的是提供一种AML1基因探针，ETO基因探针,WT1基因探针，P27基因探针、C-kit基因探针的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种包括AML1基因探针，ETO基因探针,WT1基因探针，P27基因探针和C-kit基因探针的即用型杂交液。

本发明的另一目的是提供一种包括上述即用型杂交液的试剂盒。

本发明采用的技术方案是：

一种单个基因探针的制备方法，包括如下步骤：