[发明专利]牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种抗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的基因工程单链抗体、表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及其用途，所述单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体内抗感染活性。

背景技术

单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体有三种形式：1）直接在细胞质中表达；2）与其它菌体融合表达融合蛋白；3）分泌表达具有功能的单链抗体。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1）分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2）组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清楚快，肾脏蓄积很少；4）无Fc段，非特异结合低；5）易于通过基因工程大量生产；6）易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。

奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌，流行率达到了50%，导致的经济损失最大。主要是因为一方面金黄色葡萄球菌具有传染性，另一方面金黄色葡萄球菌对治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体及其制备方法和应用，该单链抗体能与金黄色葡萄球菌特异性结合并具有一定的体内抗感染活性，在用于诊断、预防及治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关试剂或药物中，具有良好的应用前景。

本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，所述中间连接肽为（GGAAGATCTAGAGGACTGACC）。

所述的单链抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本发明的一种编码所述牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的基因，其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步涉及酶切位点和识别序列，优选的进一步含有内切酶位点NotI、NcoI和识别序列，其中NcoI：CCATGG NotI：GCGGCCGC。

本发明的一种含有编码上述单链抗体基因的表达载体。

所述的表达载体为原核表达载体，优选为pOPE101-XP载体。

本发明的一种由上述表达载体转化的宿主细胞，所述的宿主细胞为JM109细胞。

本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用RT-PCR直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因V_H和轻链可变区基因V_L；

（2）利用SOE-PCR法将linker与V_H基因和V_L基因相连构建牛源性单链抗体基因；

（3）将步骤（2）的牛源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒；

（4）将步骤（3）的原核表达载体pOPE101-XP转化入大肠杆菌，培养、表达单链抗体；

（5）分离纯化步骤（4）所得培养产物即获得所述牛源性抗奶牛乳腺炎的单链抗体。（按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行）

需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例)，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得。

本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在用于制备奶牛乳腺炎的诊断试剂和诊断试剂盒中的应用。

本发明的一种牛源性抗金黄色葡萄球菌单链抗体在用于制备奶牛乳腺炎的预防、治疗药物中的应用。