[发明专利]一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。

背景技术

倏逝波检测技术是一种新型的检测技术，它是利用光波在基质内以全反射方式传输时在基质表面产生倏逝波，可以激发连接在基质表面标记有荧光分子的生物物质，从而实现对待测目标物定量或定性的检测。由于其具有不直接与待测物发生作用，穿透深度仅有数百纳米的特点，因而可有效降低噪音，消除体相中杂质的干扰，特别适合复杂环境中待测目标物的检测。近年来，发明人所在课题组开发出多种基于倏逝波检测技术的方法和仪器（如：专利CN1873450A、CN101363870A、CN1966440A、CN101666747A等）并将其成功用于水体中藻毒素、2、4-D等化合物的检测之中，取得了较好的效果。

现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些小分子（如金属离子、农药等）可与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为这类小分子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。上述能够发生特异结构变化的DNA或RNA链，被称为功能核酸（Functional Nucleic Acids，FNAs）。2008年M A.Shannon等在《Nature》上发表文章“Science and technology for water purification in the coming decades”指出未来二十年，功能核酸（如核酸酶、核酸适体等）为代表的检测技术在环境污染物的分析上具有广阔的应用前景。

利用先前开发的修饰方法，很难消除由于功能核酸在表面的非特异吸附，造成的固定效率差信号、背景噪音大、重复性不好等问题，因而急需开发功能核酸的固定化方法。鉴于检测的需要，该方法形成的修饰层应该满足以下条件：（1）能与倏逝波检测芯片共价结合，不影响芯片的物化性质；（2）能与不同基团（氨基、巯基和羧基等）修饰的寡聚核苷酸形成共价连接；（3）修饰的寡聚核苷酸数量可控；（4）非特异吸附小，背景信号低；（5）稳定性好，可多次重复使用，降低使用成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。

本发明提供的制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：

（1）将表面具有SiO₂膜的基片进行表面羟基活化；

（2）将步骤（1）得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min（如90min-120min、90min或120min）后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小时（具体可200℃烘烤12小或130℃烘烤1小时）；

（3）通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。

所述步骤（1）中，所述基片可为硅片、石英片、玻璃片或光纤。所述步骤（1）中，所述SiO₂膜的厚度可为20nm以上（如50nm）。所述步骤（1）中，所述“进行表面羟基活化”的方法如下：将表面具有SiO₂膜的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，70-110℃静置45-90分钟（具体可90℃静置60分钟）后取出基片，洗涤并干燥，然后100-120℃静置3-12h（具体可110℃静置8小时）。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法可如下：将3体积份浓硫酸和1体积份30%过氧化氢混合。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法具体具体如下：将3体积份浓硫酸（即质量分数为98.3%的硫酸溶液）和1体积份30%过氧化氢（即质量分数为30%的过氧化氢溶液）混合。

所述步骤（2）中，所述硅烷化剂具有一个可与偶联剂反应的活性基团和3个硅氧基，优选为APTES或MTS。所述步骤（2）中，所述硅烷化剂溶液可由硅烷化剂和有机溶剂组成；所述硅烷化剂与所述有机溶剂的体积配比为（0.4-5）：100，优选为2：100、0.4：100、5：100或4：100。所述有机溶剂可为甲苯或二甲苯。