[发明专利]一种大菱鲆致病菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物疫苗制备领域，具体涉及一种大菱鲆致病菌株及用该菌株制备的用于预防烂边病的灭活疫苗。 

背景技术

大菱鲆(Scophthalmas maximus) 是欧洲名贵海水鱼种，是当前欧洲的重要海水养殖鱼类之一，自1992年被引种到我国进行人工繁殖, 现已达到一定的规模，逐渐成为我国北方优秀的水产养殖品种和工厂化养殖的主要对象, 年创产值超过15亿元。然而伴随着养殖范围的扩大和养殖密度的增加,以及品种的退化,大菱鲆的病害问题也日渐突出，各种细菌性疾病、寄生虫病、病毒性疾病时有发生，且有愈演愈烈之势。其中细菌性疾病是大菱鲆养殖中危害最为严重的一种疾病。2009年以来山东威海养殖区大菱鲆爆发流行性疾病，症状首先表现为侧鳍、尾鳍颜色变浅，出现出血点，鳍条及鳍基部充血发红，各内脏器官有不同程度的发红和病变，患病大菱鲆未见溃烂便死亡，该病多发生于苗期和养成初期，传染性极强、流行范围广，死亡率极高，一旦发病，完全治愈非常困难，病鱼从鳍出现出血点至死亡仅需3～4天，属急性死亡，给养殖业主造成很大的经济损失。 

目前大菱鲆细菌性疾病的治疗目前主要依赖于抗生素，虽然有一定效果，但是并不能从根本上控制该病，而且鱼体极易产生耐药性，造成环境中的药物残留，破坏生态平衡，威胁人体的健康和安全。此外鱼群在患病期间容易产生厌食的症状，所以投喂药饵的方法也不甚理想。因此寻找治疗该病的安全有效的途径是目前亟待解决的问题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种大菱鲆致病菌株及用该菌株制备的用于预防烂边病的灭活疫苗,用以解决以往使用抗生素治疗大菱鲆烂边病时所产生的药物残留和耐药性问题，以弥补现有技术的不足。 

本发明提供一种从患有大菱鲆烂边病的组织中分离得到致病菌株WH-1-4，为鳗弧菌（Vibrio anguillarum），并于2013年6月17日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.7733。 

本发明筛选到的鳗弧菌用于制备灭活疫苗。 

所述的灭活疫苗，还包括有灭活的副溶血弧菌。 

灭活疫苗中灭活菌体的浓度分别为10⁷-10¹⁰ CFU/ml。 

上述灭活疫苗的制备方法如下： 

首先，将鳗弧菌接种于含有3%NaCl的LB液体培养基中，再将副溶血弧菌株接种于含有3%NaCl的LB液体培养基中，28?C震荡培养12-16小时，待菌液浓度达10⁹CFU/ml或分光光度计检测OD600达到0.6以上时终止培养，获得菌株的扩大培养液； 

然后，对鳗弧菌和副溶血弧菌的扩大培养液进行灭菌处理，按体积比0.5%将鳗弧菌和/或副溶血弧菌的扩大培养液加入甲醛溶液，室温灭活24-48小时，期间震荡5-10次，每次10-15分钟，得到菌株的灭活菌液； 

最后，将菌株的灭活菌液于8000g、4?C离心15分钟，弃上清液，将沉淀用灭菌磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，收集菌体，灭菌PBS重悬菌液，再将鳗弧菌和副溶血弧菌液混合，将混合菌液涂布于高盐营养琼脂平板，24-48小时候未见菌落长出，即制得灭活疫苗，存放于4?C备用。 

本发明制备的大菱鲆烂边病灭活疫苗的制备工艺简单、产量稳定，成本低，可大量获得具有较高免疫效果的灭活疫苗。使用该方法制备的灭活疫苗的免疫保护率达68.5%，该疫苗为纯生物制剂，且具有安全、环保的特点，不会产生药物残留和环境造成污染，并且该方法可从根本上遏制大菱鲆烂边病的发生和流行，为大规模制备大菱鲆烂边病灭活疫苗提供了技术支持。  

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述。 

一、筛选的鳗弧菌及其性状描述 

1、鳗弧菌的筛选  

发病大菱鲆取自山东省威海一养殖场，取侧鳍、尾鳍有出血点的大菱鲆样品，用无菌生理盐水冲洗2遍，用无菌剪刀打开腹腔，无菌操作取病鱼出血部位、肝、肾、肠等组织小块于无菌离心管中，无菌生理盐水冲洗组织块，用无菌剪刀将组织剪碎并取少量接种于3%NaCl的高盐营养琼脂培养基，28℃恒温培养24 h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行分离纯化，将纯化4次后的菌株进行常规生理生化和6S rDNA基因序列测定，确定优势菌株为鳗弧菌（Vibrio anguillarum）。 

2、鳗弧菌的培养条件