[发明专利]用于庆大霉素定量检测的荧光二氧化硅标记的免疫层析试纸及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种基于荧光二氧化硅纳米颗粒的用于定量检测庆大霉素的免疫层析试纸及制备方法。

背景技术

庆大霉素（Gentamicin，GM）是氨基糖苷类抗生素的一种，主要作用于革兰氏阴性细菌，由于其抗菌谱广、疗效佳且价格低廉而广泛应用于兽医临床，对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好疗效，也作为饲料药物添加剂使用于配合饲料中。不规范用药会引起畜产品尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留，对人类的健康构成潜在危害，造成耳毒性和肾脏毒性。国内外相继规定了庆大霉素在动物性食品中的最高残留限量，中华人民共和国农业部 2002年发布的《动物性食品中兽药最高残留量》中规定，动物性食品中 GM 的最大残留量 MRL为100 ng·mL^-1，因此亟待加强 GM 的残留检测方法研究，从而为 GM的监控提供可靠手段，为人民的食品安全提供保障。

目前国内外关于庆大霉素等残留的检测方法主要有微生物法、仪器分析和免疫分析标记技术三种。微生物法虽然原理简单，操作方便，但测定所需的时间太长，灵敏度不高。检测庆大霉素残留的理化方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）和气相色谱法等，虽然这些方法比较灵敏、精确，但由于花费大、时间长、技术要求高等原因而不适合大批量样品的筛选。免疫分析标记技术作为一种快速、特异和灵敏度较高的检测技术正逐步被应用于小分子药物残留的检测。 

免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础，通过标记物对某种物质进行定性或定量检测的研究。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物保持了抗体或抗原的活性，不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析的敏感性。因此，亟待加强该方面的研究和探讨。

发明内容

本发明要解决的技术问题：提供一种用荧光二氧化硅纳米颗粒为标记的检测庆大霉素免疫层析试纸及其制备方法，该层析试纸具有特异、灵敏、快速、简便、能定量检测微量庆大霉素的特点。

本发明的技术方案：

一种用于庆大霉素定量检测的荧光二氧化硅标记的免疫层析试纸，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联庆大霉素的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，以及用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液或金黄色葡萄球菌蛋白A溶液印制的隐形对照印迹；所述荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用荧光二氧化硅纳米颗粒标记的庆大霉素抗体制成。 

所述荧光二氧化硅纳米颗粒的粒径为50-100nm。

所述荧光二氧化硅纳米颗粒标记的庆大霉素抗体是以下方法制备的：

将1g二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入0.3-1mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流12-24h；回流液冷却后6500rpm离心5-10min，将得到的沉淀用无水乙醇洗涤，再将沉淀分散在无水乙醇中，得到氨基化的二氧化硅纳米颗粒；

将庆大霉素抗体置于2-8℃、浓度0.025-0.05mol/L、pH9.5的CBS缓冲液中，透析8-12h；将氨基化的荧光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4-8min，用所述CBS缓冲液洗涤，然后与透析后的庆大霉素抗体混合均匀，于2-8℃反应过夜，得到荧光二氧化硅的抗体复合物；向所得的抗体复合物中按1：50-120的体积比加入0.5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2-8℃反应8-12h；用质量浓度为2%的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4-8min，得沉淀；将沉淀用0.5mL浓度0.01-0.02mol/L、pH7.8的Tris-HCL缓冲液洗涤，得到所述的荧光二氧化硅纳米颗粒标记的庆大霉素抗体，于4℃保存，备用。

所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；                                               偶联庆大霉素的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。