[发明专利]利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法。

背景技术

梨树是我国的第三大果树，也是我国出口创汇的传统果品，其种类品种多、分布广，除海南省之外，全国均有栽培。梨是蔷薇科典型的配子体自交不亲和性果树，在目前栽培的品种中表现自花结实的寥寥无几，因此生产中必须配置授粉树或人工授粉，才可以获得相应的产量。从物种进化以及杂种优势利用的角度来说，自花授粉不结实性对植物是有利的。然而，对以收获果实为目的的果树生产来说，自花不结实或结实率低无疑是不利的。据粗略统计，我国每年人工辅助授粉的梨园面积达500多万亩，花费在6亿元以上。因此，许多果树研究工作者孜孜以求，寻找良策，以摆脱自花不结实性在果树生产上的负面影响，已有不少国家，如日本、美国、加拿大等，把选育自花结实性品种作为重要的育种目标之一。若能实现自花授粉结实，就能避免或减少因春季气候不稳定而导致的传粉及授粉困难、引起坐果率低并导致减产的问题，同时有利于简化梨园管理步骤及程序，因此具有重要的实践意义和推广价值。

目前，自花结实种质创新的方法主要是传统的杂交育种和突变类型的选择。但是众所周知，果树杂交新品种选育所需周期长、难度大，更新换代慢，而田间自然突变类型的发现和利用具有频率低、不确定性的特点，这在很大程度上限制了自花结实性种质的创新和应用。因此，建立高效的遗传改良技术体系，利用目标性状的定向改良来实现梨自花结实性新种质的创新则是一条较为有效地解决途径。

梨的自交不亲和性由单一位点的复等位基因控制，其中包括分别控制花柱和花粉自交不亲和性的S基因，当花粉的S基因型和花柱中S等位基因之一相同时，S基因表达产物S糖蛋白（即S-RNase）具有酶活性，会降解花粉管中的rRNA，使得花粉管不能伸长，无法完成授粉受精，因此不能结实。目前，鉴定不同梨的S-RNase技术较为成熟，GenBank中已登录的梨S-RNase基因共有56个，获得全长的有30个。通过提取和比较不同梨品种花柱中可溶性蛋白含量，发现花柱中S糖蛋白表达量高的品种，自交不亲和性强度越大，相反当S糖蛋白表达量低时，表现自交亲和性。

发明内容

本发明的目的是提供了一种利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法，包含以下步骤：

（1）构建反义表达载体pGSA1285-S3：

①根据S₃-RNase基因的mRNA序列，设计正反向引物S₃PF：5’-TGCCTCGCTCTTGAACAAA-3’（SEQ ID NO.1）、S₃PR：5’-TATATACTAGCTAGCCCCGC-3’（SEQ ID NO.2），以‘丰水’梨花柱cDNA为模版，PCR扩增获取S₃-RNase基因cDNA序列全长；

②将S₃-RNase基因全长转化PMD19载体，以转化质粒为模板，用带有酶切位点的特异引物（上游引物5’端添加的酶切位点为Nco I，下游引物5’端添加的酶切位点为BamH I）S₃-PF₂：5’-CAGCCATGGAATGTTCTCCGCTTTTGTCACTG-3’（SEQ ID NO.3）和S₃-PR₂：5’-CGAGGATCCGTTGTTTACGGTTCACGGTTTGT-3’（SEQ ID NO.4）PCR扩增长度为449bp的S₃-RNase基因反义表达片段，将带有酶切位点的反义表达片段转化PMD19载体，获得含S₃-RNase基因反义表达片段的PMD19重组质粒PMD-S₃；

③对重组质粒PMD-S₃以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收S₃-RNase基因反义表达片段和pGSA1285线性载体并连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑取氯霉素抗性单克隆，检测确定为成功构建的反义表达载体pGSA1285-S₃；