[发明专利]利用花粉介导反义表达S-RNase创制梨自交亲和新种质的方法

权利要求书

1.利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）构建反义表达载体pGSA1285‐S₃：

①根据S₃-RNase基因的mRNA序列，设计正反向引物S₃PF：SEQ ID NO.1、S₃PR：SEQ ID NO.2，以‘丰水’梨花柱cDNA为模版，PCR扩增获取S₃‐RNase基因cDNA序列全长；

②将S₃‐RNase基因全长转化PMD19载体，以转化质粒为模板，用带有酶切位点的特异引物S₃‐PF₂：SEQ ID NO.3和S₃‐PR₂：SEQ ID NO.4PCR扩增长度为449bp的S₃‐RNase基因反义表达片段，将带有酶切位点的反义表达片段转化PMD19载体，获得含S₃‐RNase基因反义表达片段的PMD19重组质粒PMD‐S₃；

③对重组质粒PMD‐S₃以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收S₃‐RNase基因反义表达片段和pGSA1285线性载体并连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑取氯霉素抗性单克隆，检测确定为成功构建的反义表达载体pGSA1285‐S₃；

（2）获得转基因苗：利用花粉介导转化pGSA1285‐S₃载体至‘丰水’花柱，完成授粉受精，并获得后代种子，通过冬季层积处理，春季播种培育获得幼苗；

（3）PCR检测转基因植株：提取上一步获得的幼苗叶片基因组DNA，以上游引物35S‐F：SEQ ID NO.5和下游引物S₃‐PR2：SEQ ID NO.4，对样品DNA进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，存在约1000bp的反义表达载体目的片段，确定为自交亲和的转基因植株。

2.根据权利要求1所述的利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，其特征在于还包括步骤(4)转基因植株的自交亲和性鉴定：采集植株开花前1～2d的花蕾，切取0.5g左右花柱，通过提取液提取、层析柱分离、蛋白质沉淀和透析，获得花柱S糖蛋白，计算每1μg花柱可溶性蛋白中含总S糖蛋白含量≦0.7ng，即为自交亲和性植株。

3.根据权利要求1所述的利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，其特征在于所述的PCR扩增的反应体系为25μL，包括2.5μL10×Buffer，2.0mmol·L^‐1MgCl₂，0.2mmol·L^‐1，0.1μmmol·L^‐1正向引物、0.1μmmol·L^‐1反向引物，0.2μLTaq酶（Takara公司）和60μg模板，PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，持续38个循环后，72℃延伸10min，10℃10min。

4.根据权利要求1所述的利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，其特征在于所述的花粉介导转化pGSA1285‐S₃载体的方法为：利用花粉介导法，将‘黄花梨’花粉悬浮于15%蔗糖溶液中，先进行超声波处理，然后再向溶液中加入pGSA1285‐S₃质粒，对混合后的溶液按相同的方式再次进行超声波处理，然后将处理后的花粉略经沉淀，用毛笔蘸取并涂抹于大蕾期的‘丰水’花柱上，完成授粉受精。

5.根据权利要求4所述的利用花粉介导反义表达S‐RNase创制梨自交亲和新种质的方法，其特征在于所述的超声波处理条件为功率160‐170W、处理时间6S、间隙时间7S、处理次数7次。

6.S‐RNase基因反义表达载体pGSA1285‐S₃在创制自交亲和种质中的应用，其特征在于所述的S‐RNase基因反义表达载体pGSA1285‐S₃通过以下方法构建：

①根据S_3‐RNase基因的mRNA序列，设计正反向引物S₃PF：SEQ ID NO.1、S₃PR：SEQ ID NO.2，以‘丰水’梨花柱cDNA为模版，PCR扩增获取S₃‐RNase基因cDNA序列全长；

②将S₃‐RNase基因全长转化PMD19载体，以转化质粒为模板，用带有酶切位点的特异引物S₃‐PF₂：SEQ ID NO.3和S₃‐PR₂：SEQ ID NO.4PCR扩增长度为449bp的S₃‐RNase基因反义表达片段，将带有酶切位点的反义表达片段转化PMD19载体，获得S₃‐RNase基因反义表达片段的PMD19重组质粒PMD‐S₃，对重组质粒PMD‐S₃以及真核表达载体pGSA1285进行Nco I/BamH I双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并分别回收S₃‐RNase基因反义表达片段和pGSA1285线性载体并连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，挑取氯霉素抗性单克隆，检测确定为成功构建的反义表达载体pGSA1285‐S₃。