[发明专利]支原体核酸恒温扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

支原体是一类介于细菌与病毒之间的原核细胞微生物，缺少细胞壁，能独立复制。寄生于人和其他灵长类动物的泌尿生殖道中，依靠高度特异的寄生机制包括独特的顶端细胞器移植并侵入到人类细胞。

近年来大量的流行病学资料提示，生殖支原体MG是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多非淋球菌性尿道炎(NGU)、前列腺炎和盆腔炎等都有关系，是性传播疾病的病原体之一。

目前，MG的主要检测方法有：培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足同时处理大量样本的需要。分子生物学方法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染，易受其他因素影响。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）感染不仅引起肺部病变，且能侵入心、脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。由于感染常无特异性表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆。

目前，MP的实验室诊断方法有培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。然而，传统的MP分离培养需3周甚至更长时间；MP快速培养法是利用MP在选择性液体培养基中生长，根据其代谢产物使培养基颜色发生改变的特点来判断MP是否生长，显著缩短了MP的培养时间，一般实验室均可开展，但在判断时需要注意假阴性。

免疫学方法包括很多，其中冷凝集试验（cold agglutinin test，CAT）的敏感性及特异性均不理想。富士明胶颗粒凝集法（polystyrene latex agglutination reaction，PLA）的灵敏度和特异性均提高，操作简单，价格便宜，无需特殊仪器设备，3小时能出报告，适合临床常规检查。ELISA间接法用于检测血清中特 异性的IgM和IgG抗体，但检测结果受免疫系统状况的影响。

分子生物学主要为检测DNA的PCR法和检测RNA的恒温扩增检测法。PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。从理论上PCR可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA。除了样本中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染。

最新发展RNA恒温扩增技术的是Gen-Probe公司的转录介导扩增法（TMA），其采用化学发光法进行终点检测，在检测中，需要打开反应管进行灭活，在污染控制上稍显不足。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous AMGlification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对生殖支原体(MG)及肺炎支原体(MP)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的支原体RNA检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种支原体的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性捕获探针。

在另一优选例中，所述的待测支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。

在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性检测探针。

在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。