[发明专利]亚洲玉米螟OfGSTe1基因及其编码蛋白和OfGSTe1基因RNAi干扰菌株构建

说明书

技术领域

本发明涉及玉米螟OfGSTe1基因片段及其编码蛋白和RNAi干扰载体。以及干扰工程菌产物dsRNA对高效氯氰菊酯的增效作用。

背景技术

亚洲玉米螟分布广泛，分布于在我国华北、东北、西北地区等粮食产区。据推测，春玉米受玉米螟危害减产量达7-10%，夏玉米减产达15%左右。在东北，玉米螟的危害尤其严重。据统计2011年，齐齐哈尔玉米螟发生面积为79.84万hm²，占全市玉米播种面积的72.58%，造成玉米产量损失8.4万吨。同时亚洲玉米螟的危害也显著加重了玉米病害的发生。

谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferase,GSTs,EC2.5.1.18）是一个古老的酶家族，催化还原性谷胱甘肽与多种亲电子物质反应，通过增加产物的可溶性，并加速其外排，以保护生命体。作为昆虫体内一类重要的保护酶系，GST参与昆虫对不利环境的适应过程。目前大量的研究揭示在昆虫体内，GST蛋白参与昆虫体内农药解毒代谢并与昆虫抗药性密切相关。GST基因在昆虫分解代谢拟除虫菊酯和有机磷类杀虫剂过程中其重要作用。

高效氯氰菊是菊酯类农药的一种。主要用于对鳞翅目害虫的防治。目前运用于高效氯氰菊酯是亚洲玉米螟防治的主要农药品种之一。目前在昆虫防治中，最低剂量的使用杀虫剂已成为绿色农业、安全农业的要求之一。

发明内容

本发明提供的是亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶的部分cDNA序列及其RNAi干扰载体工程菌株构建，目的为降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的耐受性，减少田间高效氯氰菊酯的使用量，为绿色农业和昆虫防治提供一条新的途径。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因的核苷酸序列如序列表SeqIDNo：1所示。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNo：3所示。

本发明的亚洲玉米螟OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建，其特征在于它的构建方法如下：

一、OfGSTe1基因克隆

以由亚洲玉米螟三龄幼虫总RNA反转录而成的cDNA为模板，通过如下引物，进行PCR扩增：

P1，5’-CAAAATCGACGCCAGCC-3’；

P2，5’-TGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

回收纯化PCR产物，即得OfGSTe1基因；

二、OfGSTe1基因RNAi干扰载体的构建

以步骤一得到的OfGSTe1基因为模板，通过以下引物，进行PCR扩增：

RNAiE1-P1：5’-TCGCTGCAGTCGAGGCAATGTGTATTCAGT-3’；

RNAiE1-P2：5’-GACAAGCTTTGTCCCAACAGTTGTGCG-3’；

纯化回收PCR产物，利用PstⅠ和HindⅢ对回收后的PCR产物和L4440载体进行双酶切，连接并构建RNAi干扰载体L4440-OfGSTe1；

三、OfGSTe1基因RNAi干扰菌株的构建

将步骤二构建出的RNAi干扰载体L4440-OfGSTe1导入大肠杆菌HT115中，即完成亚洲玉米螟OfGSTe1基因RNAi干扰菌株构建。

本发明包含以下有益效果：

本发明克隆得到了亚洲玉米螟GSTe1基因的部分编码区，并利用操作简单、成本低廉的自然饲喂RNAi干扰技术，探索了新的杀虫技术。不仅有可用于研究亚洲玉米螟GSTe1基因功能对高效氯氰菊酯的相互作用，还可用于降低田间高效氯氰菊酯的使用量，达到绿色、环保农业的目的。

本发明通过重组工程菌株，构建出OfGSTe1基因RNAi干扰菌株，产生的dsRNA片段降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的解毒作用，降低亚洲玉米螟对高效氯氰菊酯的耐受性，从而降低田间高效氯氰菊酯的使用量，满足绿色农业、安全农业的要求。

附图说明

图1亚洲玉米螟幼虫各龄期OfGSTe1基因表达情况的电泳图；其中1为一龄期的电泳图，2为二龄期的电泳图，3为三龄期的电泳图，4为四龄期的电泳图，5为五龄期的电泳图；

图2为亚洲玉米螟三龄幼虫对茉莉酸甲酯诱导的植物抗性取食响应过程中OfGSTe1基因的表达情况的电泳图；其中1为OfGSTe1基因未诱导表达的电泳图；2为OfGSTe1基因诱导的电泳图；