[发明专利]一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种噻苯咪唑半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

噻苯咪唑英文名TBZ(Thiabendazole)，别名：特克多；腐绝；硫苯唑；涕灭灵，分子式：C₁₀H₇N₃S，分子量：201.25，原药为白色粉末，熔点：304～305℃，310℃升华。室温时溶解度为：丙酮28g/L，甲醇9.3g/L，二甲基亚砜80g/L，二甲基甲酰胺39.0g/L，苯2.3g/L，氯仿0.8g/L。在中性及酸性、碱性水溶液中稳定。

噻苯咪唑属于苯并咪唑类药物(benzimidazoles，BMZs)，为广谱、高效、低毒驱肠虫药，由于对对蛔、钩、鞭、蛲、粪圆线虫和旋毛虫感染，均有驱除作用，至今仍在广泛使用。噻苯咪唑可引起食欲不振、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、眩晕、头痛、嗜睡及黄视等。农业部235号公告规定了动物源性食品中噻苯咪唑的残留限量为100μg/kg。

目前的TBZ检测方法多为色谱法，但是需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因为TBZ是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。在此基础上建立起来的酶联免疫检测试剂盒可快速、方便、准确的检测牛奶中的TBZ残留，可为建立监控动物源性食品中TBZ残留提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种噻苯咪唑半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。

本发明提供的噻苯咪唑半抗原，是式1所示化产物：

式1

所述噻苯咪唑半抗原的合成路线示意图见图1。

本发明还公开了式1所示产物的制备方法，包括如下步骤：

取5-羟基噻苯咪唑220 mg、邻苯二甲酸酐500 mg和吡啶2 mL在20 mL 二甲基亚砜中混合后，于80℃下搅拌反应10小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到式1所示产物，即邻苯二甲酸单噻苯咪唑酯。

本发明提供的噻苯咪唑抗原，是将式1所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。

所述噻苯咪唑抗原的结构示意图见图3。

本发明还保护所述噻苯咪唑抗原的制备方法，包括如下步骤：

（1）取式1所示产物10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；

（2）取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24 h，即可得到反应液A；

（3）称取载体蛋白50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24 h；

（4）用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；

（5）分装，于-20℃保存备用。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。

所述噻苯咪唑抗原可以作为免疫原制备噻苯咪唑特异性抗体，也可以作为包被原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。

式1所示产物、所述噻苯咪唑抗原、所述抗体均可应用于检测噻苯咪唑。

本发明还公布了应用噻苯咪唑抗原和噻苯咪唑单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。

所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有噻苯咪唑抗原的酶标板、酶标抗体工作液、噻苯咪唑系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。

本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明克服了现有检测技术中对噻苯咪唑样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的噻苯咪唑人工抗原，通过免疫动物可产生了针对噻苯咪唑的特异性抗体，用于快速检测食品中的噻苯咪唑残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。

附图说明