[发明专利]一种噻苯咪唑半抗原制备方法及其应用

权利要求书

1.一种检测噻苯咪唑酶联免疫试剂盒的制备方法，它包括制备：

（1）包被噻苯咪唑半抗原-卵清蛋白偶联物的酶标板；

（2）酶标噻苯咪唑抗体工作液；

（3）噻苯咪唑标准品：浓度分别为0、1、3、9、27、81μg/L；

（4）底物显色液：由A液和B液组成，A液为2%过氧化脲的水溶液，B液为1%四甲基联苯胺的水溶液；

（5）终止液：0.2M硫酸水溶液；

（6）浓缩洗涤液：每1升所述洗涤液是按照如下方法配制得到的：将10mL吐温-20、5g叠氮化钠和990mL磷酸盐缓冲液混合，得到所述洗涤液；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01M pH值为7.4；

（7）浓缩复溶液：0.04mo1/L的磷酸盐缓冲液；

其特征在于，所述酶标噻苯咪唑抗体的制备方法包括：称取辣根过氧化物酶2mg溶解于0.5mL水中，加入0.5mL 0.06mol/L NaIO₄溶液，4℃避光作用30min；加入160mmol/L的乙二醇0.5mL，室温作用30min；加入噻苯咪唑单克隆抗体2mg，混匀后装入处理过的透析袋中，置1000mL的0.05mmol/L碳酸钠缓冲液中透析，4℃过夜；透析液吸至10mL的离心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH₄溶液，混匀后置4℃ 2h；加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃作用30min后4℃下3000r/min离心25min，弃上清；将沉淀溶于1.5mL 0.02mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋内，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4℃过夜，中途更换PBS 3次；将透析袋中液体吸至微量离心管中，4℃下10000r/min离心30min，将上清液吸出，加等量甘油，混匀，-20℃保存备用；

所述噻苯咪唑单克隆抗体的制备方法包括：

（1）用噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物按100μg/只，以生理盐水溶解噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c 雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次；

（2）按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂PEG4000进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5% CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液；

（3）细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞，初选采用间接ELISA方法，以噻苯咪唑半抗原-卵清蛋白偶联物包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应，筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的噻苯咪唑等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中，同时用PBS取代噻苯咪唑作对照，其余步骤同上，若经噻苯咪唑阻断后的OD_450nm值下降到对照孔的50%以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化；

（4）将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8~10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7~10日后腹腔注射杂交瘤细胞1~2×10⁶/只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用；

所述噻苯咪唑半抗原-卵清蛋白偶联物和噻苯咪唑半抗原-牛血清白蛋白偶联物的制备方法包括：取噻苯咪唑半抗原10mg，溶解于1mL二甲基甲酰胺中；取氯甲酸异丁酯50μL，于4℃下搅拌24h，即可得到反应液A；称取卵清蛋白或牛血清白蛋白50mg，加入pH9.0的碳酸盐缓冲液3.8mL，充分溶解，将反应液A逐滴滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌反应24h；用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液于4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20℃保存备用；

所述噻苯咪唑半抗原的制备方法包括如下步骤：取5-羟基噻苯咪唑220mg、邻苯二甲酸酐500mg和吡啶2mL在20mL二甲基亚砜中混合后，于80℃下搅拌反应10小时，蒸除溶剂，柱层析纯化得到产物，即邻苯二甲酸单噻苯咪唑酯，其分子结构式为：

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