[发明专利]缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及蛋白的检测技术。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓系白血病的一个特殊类型，占成人急性髓细胞白血病的10%左右，在FAB分型系统中被定义为M3型，具有发病迅速，致死率高的特点。根据“Gallagher RE,Li YP,Rao S,et al.Characterization of acute promyelocytic leukemia cases with PML-RAR alpha break/fusion sites in PML exon 6: identification of a subgroup with decreased in vitro responsiveness to all-trans retinoic acid[J].Blood,1995,86(4):1540-1547”一文报道，98%以上的APL患者体内都表达PML-RARα融合蛋白，该融合蛋白的形成干扰了野生型RARα的信号传递和PML及其核体（NBs）的正常结构与功能，在APL的发生发展中起了关键作用。PML-RARα融合蛋白被中性白细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase, NE）切割成了约53Ku和61Ku大小的两种变异蛋白，即NLS缺失的PML（NLS^-）蛋白与NLS-RARα蛋白，详见LaneAA, Ley TJ. Neutrophil Elastase Is Important for PML-Retinoic Acid Receptor α Activities in Early Myeloid Cells[J].Mol Cell Biol,2005,25(1):23-33。PML-RARα转染入在早期髓细胞中，很容易发展成为APL白血病细胞，将其转染入晚期髓细胞，结果却不能发展为APL细胞。因此，证明PML（NLS^-）蛋白存在于HL-60细胞胞浆中，就能从此角度出发在早期就可以检测出APL，为临床奠定基础。

本发明是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进发明的。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种缺失核定位信号的蛋白的定位方法，该方法准确度高，精度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，该定位方法借助激光共聚焦显微镜通过制备切片、荧光染色及分析荧光强度值等一系列手段获得了准确度高的定位PML（NLS^-）蛋白的方法，具体包括以下步骤：

A制备切片

取靶细胞涂片，并用甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片；

B荧光染色

对步骤A所得切片封闭处理后，用PML蛋白的特异性抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；

C荧光强度的获取和分析

在激光共聚焦显微镜的红绿双色荧光通道中，扫描观察用靶细胞制备的切片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果;红绿双色荧光通道中,红绿双色荧光通道扫描观察：绿光激发波长488nm，在520nm波长以上观察，红光激光波长是543nm，在580nm波长以上观察。

进一步，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，步骤B中，所述PML蛋白的特异性抗体为兔抗人PML多抗，所述荧光二抗为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔二抗多克隆抗体。

更进一步，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，步骤B中，所述兔抗人PML多抗来自ABCAM公司，作1:300倍体积稀释，所述荧光二抗源自北京中杉金桥生物技术有限公司，作1:300倍体积稀释。其它公司的同类抗体也可以替代上述公司的抗体，但由于效价不同，需要筛选最佳的稀释比。

其中，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法中，设置有实验组、正常对照组；步骤C中，当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的2倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白。另外，所述定位方法中，设置有实验组、缺失核定位信号的PML蛋白的标准品组，其中标准品组中的缺失核定位信号的PML蛋白已知；分别读取实验组和标准品组的荧光强度，并通过实验组和标准品组中各自的荧光强度比值来计算实验组中的缺失核定位信号的PML蛋白的含量。