[发明专利]缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法

权利要求书

1.缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，所述定位方法为激光共聚焦显微镜法，其特征在于:具体包括以下步骤

A制备切片

取靶细胞涂片，并用甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片；

B荧光染色

对步骤A所得切片封闭处理后，用PML蛋白的特异性抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；

C荧光强度的获取和分析

在激光共聚焦显微镜的红绿双色荧光通道中，扫描观察用靶细胞制备的切片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果。

2.根据权利要求1所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于:步骤B中，所述PML蛋白的特异性抗体为兔抗人PML多抗，所述荧光二抗为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔二抗多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于:步骤B中，所述兔抗人PML多抗来自ABCAM公司，作1:300倍体积稀释，所述荧光二抗源自北京中杉金桥生物技术有限公司，作1:300倍体积稀释。

4.根据权利要求1所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于:所述定位方法中，设置有实验组、缺失核定位信号的PML蛋白的标准品组，其中标准品组中的缺失核定位信号的PML蛋白已知；分别读取实验组和标准品组的荧光强度，并通过实验组和标准品组中各自的荧光强度比值来计算实验组中的缺失核定位信号的PML蛋白的含量。

5.根据权利要求3所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于:所述定位方法中，设置有实验组、正常对照组；步骤C中，当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的X倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白;所述X为56.00±5.50除以24.00±6.10的值。

6.根据权利要求1所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于，还设置了激光共聚焦显微镜法的平行试验，所述平行试验为荧光显微镜试验，具体为：将步骤B所得荧光染色切片用核染色液染色，在荧光显微镜下观察，并分析荧光强度。

7.根据权利要求1所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于，在激光共聚焦显微镜法之前，还设置了预试验，所述预试验为用Western blot法，具体为:将靶细胞裂解后提取细胞浆蛋白用Western blot法检测，所述Western blot法中，一抗为兔抗人PML多抗，二抗为羊抗兔多抗；用化学发光显影成像，并对印迹进行定量分析。

8.根据权利要求7所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于：所述一抗和所述二抗均为1：1000倍体积稀释。

9.根据权利要求7所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于，所述Western blot法中，设置有实验组、缺失核定位信号的PML蛋白的标准品组，其中标准品组中的缺失核定位信号的PML蛋白已知；分别读取实验组和标准品组的荧光强度，并通过实验组和标准品组中各自的荧光强度比值来计算实验组中的缺失核定位信号的PML蛋白的含量。

10.根据权利要求7所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于：当实验组印迹的荧光强度平均值为正常对照组印迹的荧光强度平均值的Y倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白;所述Y为1.5800±0.002除以0.1100±0.002的值。