[发明专利]miRNA检测方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种检测miRNA的新方法(称为aLHCD)、及其在生物学检测和临床医学中的应用。

背景技术

miRNA是约22个碱基长的微型非编码RNA，它的产生是一个梯级的过程。RNA聚合酶II或III转录产生的长非编码RNA(称为pri-miRNAs)，首先由RNA酶DROSHA剪切，产生约60-70bp长的前体分子(称为pre-miRNAs)，再经由DICER剪切，产生成熟的miRNA【D.P.Bartel,Cell，116(2),281(2004)，K.Okamura,Wiley Interdiscip Rev RNA，3(3),351(2011)】。

现今，业已证明miRNA是基因表达调控的一个关键子，它可影响几乎每个细胞生物学事件，并能参与大部分的人类疾病【Y.Huang,X.J.Shen,Q.Zou et al.,J Physiol Biochem，67(1),129(2010)】。

由于miRNA如此重要，对其研究呈爆炸性的增长，但miRNA检测方法的研究明显滞后于miRNA自身的研究。

MiRNA检测方法明显滞后的原因，主要是由miRNA自身独特的特点所决定的【K.A.Cissell,S.Shrestha,and S.K.Deo,Analytical Chemistry79(13),4754(2007);M.de Planell-Saguer and M.C.Rodicio,Anal Chim Acta699(2),134(2011)】：一是miRNA分子碱基序列特别短，杂交时的退火温度低，从而影响杂交的严紧性；二是miRNA与其家族成员仅有几个碱基乃至单个碱基的区别，与其多个靶基因也有相似的序列，与其前体更是有完全相同的序列【P.Chugh and D.P.Dittmer,Wiley Interdiscip Rev RNA3(5),601(2012);H.Zhou,M.L.Arcila,Z.Li et al.,Nucleic Acids Res40(13),5864(2012);M.Thomas,J.Lieberman,and A.Lal,Nat Struct Mol Biol17(10),1169(2010)】，这对miRNA的检测特异性提出了极大的挑战；三是miRNA没有poly-A尾巴和5'帽子，这阻止了常规方法对其特异性的纯化，从而影响检测的灵敏度和特异性；四是miRNA极短的碱基序列也使引物的设计十分困难，从而影响PCR方法的运用；五是不同的GC含量需要不同的退火温度，特别是对miRNA这样很小的分子而言更为明显，这就严重影响了多个miRNA的同时检测。

尽管困难重重，各种各样的miRNA检测方法也涌现出来【K.A.Cissell and S.K.Deo,Anal Bioanal Chem394(4),1109(2009);S.Takada and H.Asahara,Mod Rheumatol(2012)】。目前为止，常用的miRNA检测方法主要有三大类，其中Northern blotting被看成是检测单个miRNA的金标准，PCR适合高灵敏的检测，芯片适合高通量的分析【P.Chugh and D.P.Dittmer,Wiley Interdiscip Rev RNA3(5),601(2012);M.de Planell-Saguer and M.C.Rodicio,Anal Chim Acta699(2),134(2011);E.van Rooij,Circ Res108(2),219(2011)】。但是Northern blotting方法操作复杂，费时费力，灵敏度低，不适合高通量分析。stem loop-PCR因为引物的设计有很大的困难限制了它的应用。芯片虽然可用于多通量的分析，但特异性和可重复性低。

总之，目前的方法很难做到对miRNA高特异、高灵敏和便利性的检测【P.Chugh and D.P.Dittmer,Wiley Interdiscip Rev RNA3(5),601(2012);K.A.Cissell and S.K.Deo,Anal Bioanal Chem394(4),1109(2009)】。因此，本领域迫切需要开发高特异、高灵敏和便利性的、可同时检测多种miRNA的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高特异、高灵敏和便利性的、可同时检测多种miRNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种miRNA检测方法，包括步骤：