[发明专利]miRNA检测方法及应用

权利要求书

1.一种miRNA检测方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将含miRNA的样品与核酸杂交探针进行液相杂交，从而形成含“miRNA-杂交探针”的第一复合物的液相混合物，其中所述的核酸杂交探针为双发夹核酸探针，并且所述的双发夹核酸探针具有：

(i)位于5'端的第一发夹结构区；

(ii)位于3'端的第二发夹结构区；以及

(iii)位于所述第一发夹结构区和第二发夹结构区之间的、与待检测的miRNA互补的互补结合区；

(b)对所述的“miRNA-杂交探针”第一复合物，用限制性内切酶进行消化，从而从所述第一复合物中切除第一发夹结构区或第二发夹结构区，形成一端保留发夹结构区的、经酶切的第二复合物，其中所述的限制性内切酶仅切除第一发夹结构区或第二发夹结构区而不切割第一复合物的其他区域；

(c)用单链外切酶对所述第二复合物进行消化，从而切除所述第二复合物中在步骤(b)中切除发夹结构区所暴露出的核酸单链，形成第三复合物，并同时切除多余的未杂交探针，其中所述第三复合物由经双重消化后的核酸探针和miRNA构成；

(d)以所述的经双重消化的核酸探针为模板，用引物进行PCR扩增，从而获得PCR扩增产物，其中所述扩增产物含有对应于所述待测miRNA序列的核酸序列区；

(e)检测所述PCR扩增产物的存在与否和/或数量，从而得出待测miRNA的检测结果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，所述的PCR扩增为桥接PCR扩增。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，在所述的桥接PCR扩增中同时使用桥接引物对和通用引物对，其中，桥接引物对特异性结合于所述的经双重消化的核酸探针，而所述通用引物对特异性结合于所述桥接引物对的外侧。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的桥接引物对由第一桥接引物和第二桥接引物构成，其中第一桥接引物特异性结合于所述经双重消化的核酸探针中残留的发夹结构区，而第二桥接引物特异性结合于所述经双重消化的核酸探针中互补结合区。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，通过亲和素-生物素复合物信号放大技术，检测所述PCR扩增产物。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的通用引物对的部分或全部引物带有生物素标记；

或者所述的通用引物对的上游引物和/或下游引物带有生物素标记。

在步骤(d)中，通过亲和素-生物素复合物信号放大技术，检测所述PCR扩增产物。

7.如权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，通过标记酶显色进行显色判读；或通过印迹法或macroarray方法进行检测。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：

●第一发夹结构区具有双链的第一茎部区和单链的第一茎环区(loop)；

●第二发夹结构区具有双链的第二茎部区和单链的第二茎环区(loop)；

●所述各茎部区的长度为6-12bp，较佳地7-10bp；

●所述各茎环区的长度为4-12bp，较佳地4-10bp，更佳地4-8bp；

●所述的互补结合区与所述第一发夹结构区和/或第二发夹结构区之间存在0-3bp的间隔区；较佳地，间隔区的长度为1-2bp；

●所述互补结合区的长度与待检测的miRNA的长度一致，为18-30bp。