[发明专利]突变体青霉素G酰基转移酶

说明书

本发明是申请日为2009年12月22日、申请号为200980152465.6、题为“突变体青霉素G酰基转移酶”的申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及经突变的青霉素酰基转移酶和用于制备β-内酰胺抗生素的方法，其中在存在经突变的青霉素酰基转移酶时借助于活化的侧链将β-内酰胺核心酰化。

发明背景

β-内酰胺家族的抗生素是临床应用中最重要的一类抗菌化合物。天然存在的β-内酰胺抗生素的较窄杀菌谱、它们较低的酸稳定性和越来越多的抗性问题引起了对于半合成抗生素（SSA’s）（例如半合成青霉素（SSP’s）和半合成头孢菌素（SSC’s））的开发。通常，半合成β-内酰胺抗生素的化学合成在低温下使用反应性中间产物和有机溶剂在严苛条件下进行，这导致较高的下游加工成本和环境不友好的过程。因此人们持续努力，以通过酶促转化代替传统化学方法，以便获得更加可持续的半合成β-内酰胺抗生素生产。

天然β-内酰胺典型地由β-内酰胺核心（例如6-氨基-青霉烷酸(6-APA)、7-氨基-去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)及其他）和所谓的侧链组成，所述侧链通过酰胺键与核心连接。青霉素G酰基转移酶(EC3.5.1.11)是一种水解酶，其被广泛用于去除青霉素G(PenG)、头孢菌素G(CefG)和相关抗生素的侧链，从而生产相应的脱酰的核心6-APA和7-ADCA以及各自被释放的侧链（在PenG和CefG的情况下为苯乙酸(PAA)）。这些脱酰的β-内酰胺中间产物是SSA（例如氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定、头孢克洛、头孢丙烯、头孢噻肟等等）的构造块（building blocks）。关于PenG酰基转移酶的最近综述见Rajendhran J,and Gunasekaran P.,J Biosci.Bioeng.(2004),97,1-13,Arroyo M et al.,Appl Microbiol Biotechnol.(2003)60,507-14,Sio CF and Quax WJ.Curr Opin Biotechnol.(2004),15,349-55,Chandel,A.K.et al.Enzyme and Microbial Technology(2008),42,pp.199-207。

除了对β-内酰胺化合物脱酰基之外，已发现PenG酰基转移酶和氨基酯水解酶也可以被用于合成β-内酰胺抗生素。在该过程中，PenG酰基转移酶催化被活化的侧链与脱酰的β-内酰胺中间产物（例如6-APA、7-ADCA、7-ACA及其他）的缩合。酶催化的β-内酰胺抗生素合成可以在平衡受控的转化过程中发生，或在动力学受控的转化过程中发生。在平衡受控的转化条件下，可以达到的产物累积水平受到反应热动力学平衡的控制，这在半合成抗生素的合成中是不想要的，特别是当反应在水性介质中进行时。在动力学受控的转化中，酶催化酰基从活化的侧链（即酰基供体）转移到β-内酰胺核心（即亲核受体）。为了制备半合成的青霉素，被活化的侧链可以是酰胺衍生物或是芳香族羧酸的甲基酯。在这种情况下，产物累积水平受酶的催化特性控制，并且可瞬时获得酰基转移产物的高的非平衡浓度。SSA’s的合成中使用的侧链的例子是经活化的苯基甘氨酸、经活化的羟苯基甘氨酸、经活化的二氢苯基甘氨酸等等。

PenG酰基转移酶通过酰基-酶中间产物催化酰胺和酯的水解，所述中间产物中β-亚基的N-端丝氨酸被酯化至酰基。在水解的情况下，水攻击酰基-酶并且驱动水解完成。存在添加的外界亲核试剂（例如6-APA、7-ADCA）的氨基时，亲核试剂和水均攻击酰基酶，分别产生想要的酰基-转移产物（抗生素）和不想要的经水解的酰基供体。