[发明专利]突变体青霉素G酰基转移酶

权利要求书

1.源自野生型青霉素G酰基转移酶的突变体原核青霉素G酰基转移酶，其特征在于，所述突变体：

a.在氨基酸位置B460或[B148+B460]或[B24+B460]上具有氨基酸取代，所述氨基酸位置基于氨基酸序列为SEQ ID No:1中所示的Escherichia coli青霉素G酰基转移酶的氨基酸编号；并且

b.其中B24、B148和B460上的突变分别为F24A、V148L和F460L；并且

c.其中所述野生型青霉素G酰基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1中所示。

2.编码权利要求1所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶的核酸序列。

3.包含如权利要求2所述的核酸序列的表达载体。

4.包含如权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。

5.用于生产半合成的β-内酰胺抗生素的方法，所述方法包括经活化的侧链与β-内酰胺核心的酶促偶联，其特征在于使用如权利要求1所述的突变体原核青霉素G酰基转移酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述半合成的β-内酰胺抗生素选自由半合成的青霉素和半合成的头孢菌素组成的组。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述半合成的青霉素是阿莫西林或氨苄西林。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述半合成的头孢菌素是头孢氨苄、头孢羟氨苄或头孢拉定。

9.用于在存在权利要求1定义的突变体原核青霉素G酰基转移酶时生产阿莫西林的方法，所述酶催化活化形式的HPG与6-APA的偶联，其中经活化的HPG与6-APA的摩尔比≤3.0，并且以6-APA摩尔/摩尔为基础并且在酶促偶联反应后测量的阿莫西林产率≥90％，其中所述酶具有下述特性：从500mmole/升HPGM和530mmole/升6-APA生产阿莫西林，并且在测试A中条件下进行的转化结束时产生少于5mmole/升的6-APA，所述测试A为：

将用于催化HPGM偶联至6-APA的被固定的酶装入装有筛底和搅动器的2升不锈钢反应器，所述筛底具有140μm的孔；

通过添加水将体积调节至1000ml；

将内容物冷却至10℃，并借助于蠕动泵使反应器内容物在筛底上流通；

添加162.2g 6-APA，之后添加144g HPGM；

通过添加水将体积调节至1500ml；

搅动混合物并使其在筛上流通；

将温度维持在10℃；

监测pH，最初pH为6.3，一段时间后提高至7，随后降低；

在pH小于pH＝6.3的时间点，反应几乎完全；

在所述时间点从回流线中采样，过滤并通过HPLC分析残余的6-APA含量。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG是选自甲基酯和乙基酯组成的组的酯。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG与6-APA的摩尔比≤2.5。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG与6-APA的摩尔比≤2.0。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述经活化的HPG与6-APA的摩尔比≤1.5。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率≥91％。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率≥92％。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率≥93％。

17.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率≥94％。

18.根据权利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林产率≥95。