[发明专利]绿色荧光蛋白放射免疫试剂盒及其制备方法和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，具体地，涉及一种绿色荧光蛋白放射免疫试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

绿色荧光蛋白(GFP)是一种在转基因动物生产中广泛应用的标记蛋白。于1962年在一种学名为Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会吸收蓝光的部分能量，发出绿色荧光。这一特性被用于活体生物标记，在蓝光照射下对生物样本进行实时显微镜观察。

绿色荧光蛋白属于低等动物的蛋白质，在转基因大家畜生产中，绿色荧光蛋白蛋白属于外源性蛋白，绿色荧光蛋白在转基因大家畜体内可能残留于动物的内脏以及各种器官组织。

目前，GFP残留的检测方法分为定性检测及定量检测。定性检测包括荧光观察、免疫组化、Western blot等，定量检测可以通过ELISA方法。

通过ELISA方法定量检测GFP残留，显色时间不容易控制，检测灵敏度受到免疫反应显色精确度的限制。对于少量残留的检出率低，不利于精确检测。

发明内容

本发明的目的是建立一种简便的、高灵敏度的绿色荧光蛋白放射免疫检测方法，并提供一种简便的、高效的检测绿色荧光蛋白的放射免疫试剂盒，用于定量检测绿色荧光蛋白。

该试剂盒包括了放射性核素标记的绿色荧光蛋白、绿色荧光蛋白多克隆抗体、缓冲液A、缓冲液B、PR分离剂、绿色荧光蛋白标准品。

其中，放射性核素标记的标记物为¹²⁵I，标记方法为氯胺T法，每100μl放射性活度约20000cpm；

缓冲液A：0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2；

缓冲液B：1%牛血清白蛋白，0.1%冷海鱼皮胶，0.05%叠氮钠，0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.2；

GFP标准品：购自vector公司；产品号MB-0752。

绿色荧光蛋多克隆抗体（GFP多抗）：购自chemicon公司；产品号AB3080。

PR分离剂：驴抗兔二抗（1：1000稀释），6%聚乙二醇（PEG），γ球蛋白，0.1M磷酸缓冲液(PBS)pH7.4。

驴抗兔二抗：购于北方生物技术研究所；

标准品溶液为9个浓度梯度，为1pg/ml，2pg/ml，4pg/ml，8pg/ml，16pg/ml，32pg/ml，64pg/ml，128pg/ml，256pg/ml；

该试剂盒还包括反应管，所述反应管材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚丙乙烯，优选为聚苯乙烯。

本发明另一方面提供检测绿色荧光蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理

对血液样本，4℃离心4000rpm，5min，分离血清；

对组织样本，采用组织蛋白提取液进行组织总蛋白提取；

（2）应用上述试剂盒检测样品，测定沉淀放射性计数；

（3）绘制标准曲线，计算样品蛋白含量。

本发明一优选实施例中，具体包括以下检测步骤：

（1）样品前处理

对血液样本，4℃离心4000rpm，5min，分离血清；

（2）本实验采用平衡法，按下列步骤操作：

1）在聚苯乙烯试管上编号，包括总管（T管）、非特异管（NSB管）、零结合管(S₀管)、标准管（S₁-S₉管）、样本管(U管)，以上试管必须双管标号；

2）向S₁-S₉管加入200μl标准品、100μlGFP多克隆抗体及100μl¹²⁵I–GFP；

3）向U管加入200μl待测样本、100μlGFP多克隆抗体及100μl¹²⁵I–GFP；

4）向NSB管加入200μl缓冲液A、100μl缓冲液B及100μl¹²⁵I–GFP；

5）向S₀管入200μl缓冲液A、100μlGFP多克隆抗体及100μl¹²⁵I–GFP；

6）充分混匀，放置4℃24h；

7）每个管分别加入PR分离剂500μl；

8）充分混匀，室温放置20min，4℃3500rpm离心25min，吸弃上清，测各管沉淀cpm数。

（3）结果计算