[发明专利]牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及牛隐孢子虫检测技术领域，尤其涉及一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒。 

背景技术

联合表达在细菌病毒中的研究主要是将毒力基因串联起来表达，这可以提高目的蛋白的免疫原性，将其制备成疫苗可以获得更高的保护率；或者将两段不同来源的目的基因联合一起，就可同时获得两个不同来源的蛋白，将目的蛋白制成疫苗免疫，即可让动物产生两个不同病源的抗体，从而有效防御两个病原的入侵。如，有报道将猪繁殖与呼吸综合征病毒高度保守的N基因和流感病毒HA基因进行联合表达，利用流感的血凝素HA基因可以跟HA单抗特异性反应，建立了检测PRRSV抗体的乳胶凝集试验，检测结果显示与IDEXX公司ELISA试剂盒符合率达93.8%。上述思路对于开发各种试剂盒有很大的指导意义，联合表达有良好的应用前景。 

在寄生虫研究方面，联合表达的报道比较少，杨兴等人串联融合表达牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)双拷贝p33表面蛋白，其融合蛋白可被T.sergenti阳性血清识别，具有较好的反应原性，但是其并没有跟单拷贝的P33表面蛋白的效果进行比较，因而未能体现出联合表达的优势。江莉等人为了提高细粒棘球蚴AgB抗原在诊断中的敏感性和特异性，将AgB1和AgB2两个亚单位基因在同一载体中进行联合表达，并通过血清抗体检测跟单基因表达的AgB1和AgB2相比较，结果发现联合表达的AgB在血清学诊断意义上远优于单基因抗原AgB1或AgB2。 

虽然有些抗寄生虫药、抗病毒药和抗生素都被用来研究抗隐孢子虫的效果，然而效果都不稳定，无法根除隐孢子虫，因此预防措施显得尤为重要。除了保持良好的日常生活生活习惯之外，药物预防和疫苗的预防均是可行方法。自从预防伪狂犬病取得成功后，基因工程疫苗就受到广大学者的高度关注，其跟常规疫苗相比，具有许多优势，深受欢迎。以串联不同基因蛋白表达为基础制造的基因工程多价苗比单价苗具有更为广泛的疫病防治范围，能提高疫苗的免疫保护率。因此，蛋白串联表达具有十分重要的应用意义和广阔的前景。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，以利于牛隐孢子虫病的免疫预防和免疫诊断。 

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，包被酶标板以卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70作为包被抗原。 

卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70分别由序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的基因编码；串联体COWP-HSP70由序列表SEQ.ID.No.3的基因编码。 

包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；封闭液为1%脱脂奶；包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。 

阴性标准血清是未免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清； 

阳性标准血清是免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清； 

酶标二抗是羊抗鼠-IgG； 

洗涤液由NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL而得； 

稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得； 

底物液是TMB显色液； 

终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得； 

包被液由Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1 000mL而得。