[发明专利]牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒

权利要求书

1.一种牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，包括包被酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、酶标二抗、洗涤液、稀释液、底物液和终止液，其特征在于：所述包被酶标板以卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70的串联体COWP-HSP70作为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70分别由序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的基因编码；所述串联体COWP-HSP70由序列表SEQ.ID.No.3的基因编码。

3.根据权利要求2所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述包被酶标板是用包被液将包被抗原稀释至0.05275μg/mL，加入96孔酶标板，100μL/孔，置于湿盒37℃作用2h后，4℃过夜；用PBST洗板3次，拍干，用封闭液封闭酶标板，置于湿盒37℃作用1h，用PBST洗板3次，拍干制得；所述封闭液为1%脱脂奶；所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液。

4.根据权利要求2所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：

所述阴性标准血清是未免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清；

所述阳性标准血清是免疫安氏隐孢子虫卵囊的健康BALB/c小鼠血清；

所述酶标二抗是羊抗鼠-IgG；

所述洗涤液由NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1 000mL而得；

所述稀释液由脱脂奶粉1.0g，加洗涤液定容至100mL而得；

所述底物液是TMB显色液；

所述终止液由浓硫酸22.2mL，加蒸馏水177.8mL而得；

所述包被液由Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1 000mL而得。

5.根据权利要求4所述的牛隐孢子虫ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述阳性标准血清采用皮下注射免疫方法，将安氏隐孢子虫卵囊经过超声破碎后，12000rpm离心10min，经过0.22μM滤膜过滤后，测定蛋白浓度；免疫18-20g的BALB/c小鼠，按体积比1:1与弗氏佐剂混合均匀，用超声破碎仪破碎震荡20min充分乳化；免疫剂量为100μg/只，共免疫3次，间隔2周；同时用PBS免疫2只BALB/c小鼠，作为对照组；其中第1次免疫用弗氏完全佐剂FCA，加强免疫用福氏不完全佐剂FIA；三免后一周摘眼球采血，从而分离到的血清。