[发明专利]一种基于磁分离-量子点免疫荧光传感检测生物大分子的方法及其试剂制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测生物大分子的方法，尤其涉及一种基于间接信号分析模式的磁分离-量子点免疫荧光传感检测方法及相关试剂制备与使用方法。 

背景技术

传染性的动植物致病菌和病毒是出入境检验检疫工作中重点监控对象，对这些具有传染性的有害生物进行快速、准确、便捷的检测，对保护人类健康及生命安全、保障国门安全、维护社会稳定具有重要的意义。 

目前检测该致病菌和病毒的检测方法主要包括分离培养检测、免疫学检测、分子生物学等方法。分离培养方法简单、易行，但由于其检测灵敏度低、耗时长，无法达到检疫要求。免疫分析法具有简单、快速、成本低等优点，适合于大规模样品筛查，但其灵敏度比较低，因此其使用也受到一定的限制。分子生物学方法检测灵敏度较高，特异性较好，但需要昂贵的仪器和较高的专业技术，因此其应用受到一定限制。因此，口岸检验检疫急需建立一种快速、灵敏检测致病菌和病毒的方法。 

基于超顺纳米磁珠的免疫磁性分离技术具有免疫反应的高度特异性和磁性分离的快速、简单和高效的优点，是目前应用最广泛的磁分离技术，近几年已被广泛地应用于肿瘤细胞分离、富集、目标蛋白质和多肽的富集、临床诊断、食品安全快速检测、环境监测等领域方面的研究中。在免疫磁富集反应中，免疫磁珠和目标物的识别是在悬浮溶液中进行的，是一种均相的免疫反应形式，因此可以和其他很多技术结合起来，构建一系列新型的分析方法，例如磁分离-荧光免疫分析方法，磁分离-化学发光分析方法，磁富集-微流控芯片技术，磁分离-表面等离子共振生物传感器，磁富集-石英晶微天平生物传感器等方法。由于免疫磁分离技术的发展，大大促进了相关分析技术的发展，其应用潜力正在不断地发掘出来。 

量子点作为一种新型的荧光/磷光探针在荧光成像、食品和环境中农兽药残留、相关致病菌和病毒的检测，生物芯片多靶标检测等领域得到了广泛地应用，其具有许多优越的光学性质：荧光强度稳定，抗光漂白性强；具有一元激发，多元发射的优势，是一种理想的多元标记材料；激发谱带宽、发射谱对称而狭窄，且发射波长与其粒径相关，能有效克服有机荧光探针发射光谱较宽和易与受体的发射光谱重叠的弱点，适合多元检测。 

目前，已经有很多研究者将量子点优异的荧光性能和免疫磁性分离技术的优势结合起来，构建了磁分离-荧光免疫传感器，该传感器和传统的ELISA相比，具有样品前处理少，分析速度快、灵敏度高，可以实现高通量、多靶标检测，已经在食品和环境安全、检验检疫等领域得到了广泛地应用。但传统的磁分离-量子点传感器存在需要解决的问题，传统的磁分离-量子点免疫传感器的荧光信号来自免疫磁珠通过抗原-抗体特异性反应结合上的量子点免疫探针，这种分析模式有两个缺点：第一，免疫磁珠本身有荧光，会造成荧光背景干扰；第二，量子点的直径比免疫磁珠小一个数量级，当激光照射过来以后，磁珠另外一表面的量子点的荧光无法被有效地激发，这种现象就如同“白天和黑夜”的现象，因此造成有效的荧光信号损失。针对第一种来自超顺磁珠的背景荧光干扰问题，有研究者通过调节量子点的荧光发射峰的位置，避开免疫磁珠本身的荧光峰位置，基本上可以克服荧光背景值的问题。但对于第二个问题的解决办法，目前还没有相关的报道。为了克服上述的缺点，扩展该荧光传感器的应用范围，本章拟采用一种新型的间接信号分析模式，当加入的量子点免疫探针总量一定的条件下，检测没有结合在免疫磁珠上的量子点的荧光强度就可以反推出样品中目标物的含量。 

发明内容

在本发明中，我们构建了一种普适性的，快速，灵敏的均相免疫传感器用致病菌和病毒的检测，该免疫传感器基于磁分离-量子点间接荧光信号分析模式。在间接信号分析模式中，剩余的量子点免疫探针的荧光强度作为荧光信号，从而避免来自超顺纳米磁珠自身荧光干扰问题，采用间接信号分析模式不仅可以避免背景荧光干扰的问题，而且可以提高有效的荧光 信号值，进而提高方法的灵敏度。另外间接信号分析模式不需要重新悬溶免疫磁珠-量子点免疫复合物，从而简化了实验操作步骤图1。 

基于间接信号分析模式的超灵敏QDs-MB免疫传感器用于生物大分子的检测步骤如下： 

1.超顺纳米免疫磁珠MB-Ab1(1)的制备 

1.1磷酸盐缓冲溶液PBS的配制：磷酸氢二钠0.2mol L^-1和磷酸二氢钠0.2mol L^-1按照一定量的比例混合，配制成0.01mol L^-1磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.0-7.4。