[发明专利]一种基于磁分离-量子点免疫荧光传感检测生物大分子的方法及其试剂制备方法

权利要求书

1.一种基于磁分离-量子点免疫荧光传感检测生物大分子的方法，其特征在于，用超顺纳米磁珠MBs为载体经功能化修饰后与抗待测生物大分子的抗体Ab₁偶联而制得捕获抗体MB-Ab₁；将量子点经功能化修饰后与抗待测生物大分子的抗体Ab₂偶联而制得量子点荧光探针QDs-Ab₂；利用MB-Ab₁从试样中特异性富集待测生物大分子Ag，制得系列复合物MB-Ab₁-Ag；使MB-Ab₁-Ag与QDs-Ab₂反应形成MB-Ab₁-Ag-Ab₂-QDs，经磁分离使之与液相QDs-Ab₂免疫荧光探针分离；测量QDs-Ab₂荧光强度X，利用待测生物大分子浓度C与X之间呈现的反相关函数关系而实现传感检测待测生物大分子浓度；其步骤为， 

(1)超顺纳米磁珠MBs与抗体Ab₁的偶联： 

a.超顺纳米磁珠的活化：取1-5mg颗粒直径为100-2000nm、具有羧基的超顺纳米磁珠于1.5mL离心管中，通过磁分离，去掉上清液得到超顺纳米磁珠，加入100-1000μL磷酸盐缓冲溶液，置于超声波清洗器中超声30s后放入涡旋振荡器中振荡10s，加入5-20μL浓度为50mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS和5-20μL浓度为50mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，摇振20min；通过磁分离，去掉剩余的活化剂和副产物，再用pH＝7.4的PBS缓冲溶液洗涤，洗涤2-3次，再溶于100-1000μL上述PBS缓冲溶液，得到活化的超顺纳米磁珠悬浮液。 

b.抗体与活化的超顺纳米磁珠的偶联：取80-100μL上述活化纳米磁珠悬浮液于离心管中，加入蛋白含量为5-10mg/mL的Ab₁抗体0.3-0.5mg，摇振0.5-2h，通过磁分离去掉未反应物，再将磁珠溶于500-1000μL上述封闭液，反应半小时，再通过磁分离去掉上清液，加入200-1000μL洗涤液PBST重新溶解，在涡旋振荡器中振荡30s再进行磁分离，该洗涤步骤重复2次，再用1000μL的PBS溶液复溶，得到磁免疫亲和富集试剂MB-Ab₁，保存于4℃冰箱中。 

(2)量子点QDs与抗待测生物大分子的抗体Ab₂的偶联： 

a.量子点QDs的活化：取200-500μL表面修饰有羧基的量子点加入到1.5mL离心管中，置于超声波清洗器中超声30s后放入涡旋振荡器中振荡10s，再加入10-50μL质量浓度为5 mg/mL的NHS和10-50μL浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，摇振10-20min进行活化。 

b.抗生物大分子抗体Ab₂与QDs的偶联：将为蛋白含量5-10mg/mL的Ab₂抗体0.2-0.3mg加入到上述活化好的QDs悬浮液中，摇振0.5-2h，加入500-1000μL上述封闭液反应0.5h，用分子量为100kd的超滤离心管在离心力为8000g下离心15min，去掉下清液，用100-500μL的PBS溶液重溶QDs-Ab₂，用分子量为100kd的超滤离心管在离心力为8000g下离心15min，该步骤重复2-3次，最后用100-500μL的PBS溶液复溶QDs-Ab₂，制得QDs-Ab₂荧光免疫探针。 

(3)试样中待测生物大分子Ag的富集： 

a.亲和富集：取100μL上述MB-Ab₁溶液分别与1000μL不同浓度的待测生物大分子Ag混合于1.5mL离心管中，室温下涡旋10-15min，经磁分离后用100μL上述磷酸盐缓冲溶液复溶，制得系列复合物MB-Ab₁-Ag。 

(4)微孔板荧光检测仪间接检测试样中待测生物大分子含量： 

a.免疫反应：分别取上述系列MB-Ab₁-Ag复合物100μL于96孔细胞培养板中，分别加入100μL上述QDs-Ab₂荧光免疫探针，于37℃下反应15min，经磁分离，使MB-Ab₁-Ag-Ab₂-QDs免疫复合物与液相QDs-Ab₂免疫荧光探针分离。 

b.免疫荧光定量分析：利用多功能荧光酶标仪分别对液相QDs-Ab₂免疫荧光探针进行荧光测定，其荧光强度X与待测生物大分子浓度C符合下列函数关系式，从而间接测得了待测生物大分子浓度。 

Lg[C]＝AX+B 

C：待测物的浓度； 

X：测得量子点荧光强度； 

A和B均为常数。