[发明专利]针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体

说明书

技术领域

本发明涉及一种针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体及其制备方法和应用。 

背景技术

鸡新城疫病是鸡新城疫病毒引起的高度接触性传染病，又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，主要特征是呼吸困难、便稀、神经紊乱、粘膜和浆膜出血，死亡率高，对养鸡业为害严重。 

禽流感是一种由禽流感病毒引起的传染性疾病，被国际兽疫局定为甲类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。禽流感的常见症状：病鸡精神沉郁，饲料消耗量减少，消瘦；母鸡的就巢性增强，产蛋量下降；轻度直至严重的呼吸道症状，包括咳嗽、打喷嚏和大量流泪；头部和脸部水肿，神经紊乱和腹泻。 

鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性高度接触性呼吸道传染病，其临诊特征是呼吸困难、发出罗音、咳嗽、张口呼吸、打喷嚏。传染性支气管炎病毒主要通过空气传播，也可以通过饲料、饮水、垫料等传播。 

长期以来，禽类饲养场中的发病禽类以上述三种病毒共感染或继发感染居多。目前针对上述疾病的防治主要依赖于疫苗和抗生素。抗生素在动物体内会导致药物残留和产生抗药性。现有疫苗的有效成分为灭活病毒，禽类饲养场通常在鸡1-2周龄时免疫，在动物体内产生抗体并发挥作用需要14天左右的时间，所以在鸡1周龄至4周龄时期内，较容易出现上述一种或几种疾病的爆发。 

发明内容

本发明的目的是提供一种针对鸡新城疫病毒、禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的三联卵黄抗体及其制备方法和应用。 

本发明提供的制备卵黄抗体的方法，包括如下步骤： 

（1）按如下原则选取母鸡：未经人工免疫；已开产且产蛋正常；经检测为新城疫病毒阴性、禽流感病毒阴性且鸡传染性支气管炎病毒阴性； 

（2）用鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒三联灭活苗免疫步骤（1）得到的母鸡； 

（3）完成步骤（2）后，取母鸡生产的鸡蛋并分离得到蛋黄液； 

（4）取步骤（3）得到的蛋黄液，与等体积蒸馏水混匀，650rpm振荡10min，然后在密封状态下65℃静置10分钟，冷却至10℃后与蒸馏水以1:4的体积比混合，调pH至 5.2，4℃静置6小时，然后5000rpm离心20分钟，取上清液； 

（5）将等体积饱和硫酸铵水溶液加入步骤（4）得到的上清液中，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀； 

（6）用3质量份蒸馏水溶解1质量份步骤（5）得到的沉淀，然后加入正辛酸使其在体系中的体积比为1‰，混匀； 

（7）将1体积份饱和硫酸铵水溶液与2体积份步骤（6）得到溶液混匀，4℃静置12小时，8000rpm离心20分钟，取沉淀； 

（8）用3质量份无菌、pH7.2、0.01M的PBS缓冲液溶解1质量份步骤（7）得到的沉淀； 

（9）将步骤（8）得到的溶液用100Ku超滤膜包进行除盐浓缩，得到浓缩液； 

（10）将1体积份40%甲醛水溶液加入399体积份步骤（9）得到的浓缩液中，然后在密封状态下室温静置2小时，然后依次用0.45微米、0.22微米和0.1微米的微孔滤膜逐级过滤，得到滤液，即为卵黄抗体。 

所述步骤（1）中的母鸡可在雏鸡时免疫鸡干扰素α。所述鸡干扰素α具体如序列表的序列1所示。所述雏鸡时具体可为7日龄时的鸡。所述鸡干扰素α的免疫剂量为每只鸡15U。 

所述步骤（2）中，所述免疫包括如下步骤： 

基础免疫：每只鸡免疫l0个免疫剂量的所述三联灭活苗； 

加强免疫：基础免疫l0天后，每只鸡免疫l0个免疫剂量的所述三联灭活苗； 

强化免疫：加强免疫l0天后，每只鸡免疫20个免疫剂量的所述三联灭活苗； 

维持免疫：强化免疫10天后，每只鸡免疫l0个免疫剂量的所述三联灭活苗。 

所述步骤（2）中，所述鸡新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒三联灭活苗具体可为鸡新城疫病毒（La Sota株）、传染性支气管炎病毒（M41株）、禽流感病毒（H9亚型，HL株）三联灭活苗，更具体可为如下疫苗：洛阳普莱柯生物工程有限公司产品，兽药生字（2006）160022124。 

所述步骤（3）中还包括如下步骤：选取对鸡新城疫病毒（具体可为鸡新城疫活疫苗La Sota株）、传染性支气管炎病毒（具体可为鸡传染性支气管炎M41毒株）、禽流感病毒（具体可为H9N2亚型禽流感病毒YB株）的HI效价均大于1024的蛋黄液进行所述步骤（4）。