[发明专利]一种快速鉴定病原真菌的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定病原真菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）培养待鉴定真菌，得到真菌菌丝体、菌核、或分生孢子；

（2）取上述真菌菌丝体、菌核、或分生孢子置于缓冲液中，进行微波热振破壁处理后，置于冰上，离心后取上清液，即为真菌DNA提取液；

（3）利用真菌通用引物ITS1和ITS4对上述真菌DNA提取液进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用PCR回收试剂盒回收纯化得到目的片段；

（4）将上述目的片段直接进行序列分析，得到的核苷酸序列在NCBI网站利用blast搜索与之相匹配的真菌序列，匹配长度最长，序列一致性为100%的真菌判定为被鉴定真菌所属的真菌。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（1）所述待鉴定真菌选自：花生黄曲霉菌、花生白绢病菌、花生焦斑病菌、花生镰刀病菌、花生链格孢菌、苹果纹枯病菌、番茄叶霉病菌、小麦全蚀病菌、草坪币斑病菌、棉花黄萎病菌、瓜类蔓枯病菌、水稻稻曲病菌、黄瓜黑星病菌、玉米弯孢病菌、甘薯黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、哈密瓜枯萎病菌、白菜黑斑病菌、高粱立枯病菌、柑橘疮痂病菌、麻黄串珠镰刀真菌、辣椒炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、或禾谷镰刀真菌。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（1）所述真菌在PDA培养基或察氏培养基上进行平板或斜面培养。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（1）所述真菌在PDA培养基上28℃暗培养1～5天至菌落长至2～3cm，得到所述真菌菌丝体；或所述真菌在PDA培养基上28℃黑暗培养7～15天，得到所述菌核；或所述真菌在察氏培养基上28℃黑暗培养5～7天，得到所述分生孢子。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）所述真菌菌丝体、菌核、或分生孢子的质量为0.2～2mg。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）所述缓冲液为TE缓冲液，其组成成分为：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）所述微波热振破壁处理的微波功率为750W，微波处理的时间为30s～5min。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤（2）所述微波热振破壁处理后，立即置于冰上5～10min，然后进行离心。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述离心在室温下进行，离心的转速为10000rpm，离心的时间为1～2min。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于所述PCR扩增的体系为：10×Taq缓冲液2μl、10pmol的ITS1引物和ITS4引物各1μl、真菌DNA提取液2μl、1UTaq DNA聚合酶1μl、2.5mM MgCl₂1μl、2mmol/L dNTPs1μl、及灭菌水补足至20μl；扩增条件为：94℃3min变性，94℃30s，51℃30s，72℃1min，35个循环，72℃7min延伸。