[发明专利]一种快速鉴定病原真菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于病原真菌鉴定领域，具体涉及一种快速鉴定病原真菌的方法。

背景技术

花生病原真菌危害花生造成产量损失，影响产品的质量。为了有效防治病害，需要快速鉴定花生的病原，及时针对性防治该病害。目前对真菌除了传统的形态学鉴定外，为了得到更准确的信息，一般依赖对真菌基因组DNA信息的了解，通过真菌通用的PCR引物对真菌基因组核糖体DNA内转录间隔区扩增后得到的PCR产物进行序列分析。常规真菌DNA的提取方法为：将液体培养5-7d得到真菌菌丝团进行过滤，干燥或液氮冷冻处理后通过CTAB或SDS法破碎真菌菌丝细胞壁，再通过苯/氯仿抽提去除蛋白，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到真菌DNA。将得到的真菌DNA经过PCR扩增获得目的基因片段，再通过凝胶电泳后回收目的基因片段连接到T载体上，并转化细菌感受态细胞，转化的感受态细胞涂布平板培养后获得的单克隆通过PCR鉴定为阳性克隆，阳性克隆经过培养后的菌液提交进行序列分析。该传统方法中，真菌培养的时间比较长，需要真菌菌丝的量较多，真菌DNA提取的方法花费时间较长，耗费的试剂和人力成本也较高，步骤繁琐，真菌DNA通过PCR扩增后连接载体，转化细菌感受态，获得的克隆进行鉴定也需要至少2天时间，再加上后续的测序时间，传统的鉴定方法至少需要2周左右的时间。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种操作简单、成本低、通量高、并适用于快速鉴定病原真菌的鉴定方法。

为实现发明目的，本发明的技术方案为：

一种快速鉴定病原真菌的方法，包括如下步骤：

（1）培养待鉴定真菌，得到真菌菌丝体、菌核、或分生孢子；

（2）取上述真菌菌丝体、菌核、或分生孢子置于缓冲液中，进行微波热振破壁处理后，置于冰上，离心后取上清液，即为真菌DNA提取液；

（3）利用真菌通用引物ITS1和ITS4对上述真菌DNA提取液进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，再利用PCR回收试剂盒回收纯化得到目的片段；

（4）将上述目的片段直接进行序列分析，得到的核苷酸序列在NCBI网站利用blast搜索与之相匹配的真菌序列，匹配长度最长，序列一致性为100%的真菌判定为被鉴定真菌所属的真菌。

上述方案中，步骤（1）所述待鉴定真菌选自：花生黄曲霉菌、花生白绢病菌、花生焦斑病菌、花生镰刀病菌、花生链格孢菌、苹果纹枯病菌、番茄叶霉病菌、小麦全蚀病菌、草坪币斑病菌、棉花黄萎病菌、瓜类蔓枯病菌、水稻稻曲病菌、黄瓜黑星病菌、玉米弯孢病菌、甘薯黑斑病菌、水稻稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、哈密瓜枯萎病菌、白菜黑斑病菌、高粱立枯病菌、柑橘疮痂病菌、麻黄串珠镰刀真菌、辣椒炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、或禾谷镰刀真菌。

上述方案中，步骤（1）所述真菌在PDA培养基或察氏培养基上进行平板或斜面培养。

上述方案中，步骤（1）所述真菌在PDA培养基上28℃暗培养1～5天至菌落长至2～3cm，得到所述真菌菌丝体；或所述真菌在PDA培养基上28℃黑暗培养7～15天，得到所述菌核；或所述真菌在察氏培养基上28℃黑暗培养5～7天，得到所述分生孢子。

上述方案中，步骤（2）所述真菌菌丝体、菌核、或分生孢子的质量为0.2～2mg。

上述方案中，步骤（2）所述缓冲液为TE缓冲液，其组成成分为：10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0。

上述方案中，步骤（2）所述微波热振破壁处理的微波功率为750W，微波处理的时间为30s～5min。

上述方案中，步骤（2）所述微波热振破壁处理后，立即置于冰上5～10min，然后进行离心。

上述方案中，所述离心在室温下进行，离心的转速为10000rpm，离心的时间为1～2min。

上述PCR扩增的体系为：10×Taq buffer2μl、10pmol的ITS1引物和ITS4引物各1μl、真菌DNA提取液2μl、1U Taq DNA polymerase1μl、2.5mM MgCl₂1μl、及2mmol/L dNTPs1μl，再用灭菌水补足至20μl；扩增条件为：94℃3min变性，94℃30s，51℃30s，72℃1min，35个循环，72℃7min延伸。