[发明专利]一种菌影载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种菌影载体的构建方法。

背景技术

菌影是由于噬菌体裂解基因E在革兰氏阴性菌中表达的裂解蛋白使菌体的内外膜出现40nm-200nm的小孔，因渗透压的作用使菌体的内容物溢出而成的细菌空壳。菌影疫苗在制作过程中，受物理和化学因素的破坏因素小，基本保持了免疫原的天然结构，能够作为良好的免疫原对动物起到免疫保护作用。在国外菌影疫苗作为多联苗、多价苗即将进入市场，但在国内，对于菌蜕的研究尤其是作为运输载体的研究还刚刚起步，其中还有很多问题需要我们去研究和探讨。

菌影作为免疫原直接作用机体，也可作为载体向机体递送蛋白质、核酸以及其他药物，均获得了一定的进展。菌影作为载体递送蛋白质，主要用两种途径实现：（一）将纯化好的蛋白直接浸泡装载到菌影中，添加钙黄绿素可以使膜囊与菌影内膜相融合将菌影缝合起来；（二）利用锚定蛋白将目的蛋白固定靶向细菌内膜上。在现有的重组菌影疫苗中，用于传输外源亚单位蛋白的膜锚定序列主要有：外膜锚定蛋白OmpA（在细胞膜外表达）、胞浆周隙锚定蛋白SbsA（在细胞周质中表达）、内膜锚定蛋白E’（噬菌体PhiX174裂解蛋白E上的第1-54位氨基酸）和L’（在细胞内膜中表达）。

目前研究者利用锚定蛋白将目的蛋白固定靶向细菌内膜上制备菌影的方法均是将裂解基因E、锚定序列以及目的蛋白串联表达，这对目的蛋白的大小以及空间结构均有要求，且目的蛋白与锚定序列串联后的空间结构可能会干扰裂解基因E的表达。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种构建菌影载体的新方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种菌影载体，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2和质粒载体pET28a。

进一步地，所述菌影载体为双向表达载体，且两表达系统的方向相反。一种表达系统为pET28a原有的表达系统，可用IPTG诱导表达，用来表达锚定基因与巴氏杆菌OmpH串联基因；另一种表达系统ci857-E-T1T2方向与之相反，通过升温诱导表达裂解基因E，用于制造菌影，两个表达系统独立存在，互不干扰。

其中，所述巴氏杆菌OmpH基因来自牛巴氏杆菌标准株CVCC393。

其中，所述pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2为pBV220-E载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列，此序列构成了裂解盒。

本发明还提供了前述菌影载体的构建方法，包括如下步骤：

1）以噬菌体PhiX174RF1质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；

2）将步骤1）得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E；

3）以步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；

4）以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly₄Ser经overlap PCR将步骤3）得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’-OmpH；

5）将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoRI、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21（DE3）或Rossta（DE3）感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’-OmpH-pET28a；

6）将步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的ci857-E-T1T2基因序列（从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列）亚克隆到重组表达载体E’-OmpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。

构建得到的双向表达载体，通过热激，转入大肠杆菌BL21(DE3)或Rossta（DE3）感受态细胞中，酶切鉴定证明双向表达载体E'-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2构建成功。经IPTG、42℃迅速升温诱导表达后，SDS-PAGE、westernblot、菌影28℃培养等鉴定，证明成功制备了锚定牛巴氏杆菌OmpH的大肠杆菌菌影。

本发明还提供了前述菌影载体在大肠杆菌菌影中的应用。

本发明的有益效果在于：