[发明专利]一种菌影载体的构建方法有效
| 申请号： | 201310319778.4 | 申请日： | 2013-07-26 |
| 公开（公告）号： | CN103436550A | 公开（公告）日： | 2013-12-11 |
| 发明（设计）人： | 朱战波;姜东君;于立权;崔玉东;王鹤;梁宏儒;赵达;胡旭;高佳滨;陈为宏;尹辉;乔波;陈楠楠 | 申请（专利权）人： | 黑龙江八一农垦大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 王朋飞 |
| 地址： | 163319 黑*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 载体 构建 方法 | ||
1.一种菌影载体，其特征在于，所述菌影载体包含锚定基因E’、巴氏杆菌OmpH基因、pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2和质粒载体pET28a。
2.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述菌影载体为双向表达载体。
3.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述巴氏杆菌OmpH基因来自牛巴氏杆菌标准株CVCC393。
4.如权利要求1所述的菌影载体，其特征在于，所述pBV220-E载体的表达原件ci857-E-T1T2为pBV220-E载体基因序列中从阻遏蛋白到终止子的全部基因序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的菌影载体，其特征在于，所述菌影载体的构建方法包括如下步骤：
1）以噬菌体PhiX174RF1质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；
2）将步骤1）得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E；
3）以步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；
4）以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlap PCR将步骤3）得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’-OmpH；
5）将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoRI、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21或Rossta感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’-OmpH-pET28a；
6）将步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的ci857-E-T1T2基因序列亚克隆到重组表达载体E’-OmpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。
6.权利要求1-5任一项所述的菌影载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
1）以噬菌体PhiX174RF1质粒为模板，PCR扩增裂解基因E，将裂解基因E与T载体连接，筛选阳性质粒；
2）将步骤1）得到的阳性质粒，亚克隆到质粒pBV220中，得到重组质粒pBV220-E；
3）以步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的DNA为模板，PCR扩增E’基因；
4）以巴氏杆菌基因组为模板，PCR扩增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser经overlap PCR将步骤3）得到的E’基因与OmpH基因连接在一起，形成融合片段E’-OmpH；
5）将融合片段E’-OmpH其插入到质粒载体pET28a多克隆位点区的EcoRI、Sal I位点上，经克隆转化入大肠杆菌BL21或Rossta感受态细胞中，酶切鉴定阳性克隆，得到重组表达载体E’-OmpH-pET28a；
6）将步骤2）得到的重组质粒pBV220-E的ci857-E-T1T2基因序列亚克隆到重组表达载体E’-OmpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位点上，构建双向表达载体E’-OmpH-pET28a-ci857-E-T1T2。
7.权利要求1-5任一项所述的菌影载体在大肠杆菌菌影中的应用。
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