[发明专利]新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，具体涉及一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白；本发明还涉及这种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法。 

背景技术

氧自由基是细胞正常代谢过程中产生的副产物，正常情况下，氧自由基的产生和清除基本平衡，当机体氧自由基生成明显增多或抗氧化系统功能障碍时，堆积在体内的大量氧自由基会攻击机体，造成氧化应激反应。超氧化物歧化酶(SOD)能够催化超氧化物阴离子自由基(O₂^-·)发生歧化反应，从而有效地清除O₂^-，使细胞免受O₂^-·的氧化损伤。但由于自由基的产生和作用主要是在胞内进行的，任何外源的抗氧化剂都需要首先进入细胞，才能发挥其作用。所以SOD必须进入细胞内甚至是线粒体内才能起到抗氧化损伤的作用。然而SOD分子没有特异性受体，很难直接穿过细胞膜，其临床作用受到很大的限制。HIV-1编码的反式激活蛋白(TAT)中的蛋白转导结构域(PTD)是一种能够把生理状态下不能进入细胞发挥生物学效应的物质带入细胞内的载体工具。现已证明PTD与其他蛋白融合表达，可以使生物大分子以非受体依赖方式进入细胞，且具有转导蛋白广谱以及外源蛋白质生物活性不受影响等优点。然而现有PTD存在转导效率相对低下和潜在的细胞毒性等缺陷。针对此问题，现研究发现了一种新型的蛋白转导结构域PTD4，其通过化学合成法把其中的3个精氨酸、2个赖氨酸和1个 甘氨酸均用丙氨酸(Ala)替换，使其a-螺旋结构更加稳定，核心序列是YARAAARQARA，PTD4肽在二级结构上是一个双亲结构，双亲结构的亲水部分有利于精氨酸中带正电荷的胍基和细胞表面结合，其疏水部分更有利于穿透细胞膜，被证明具有高于TAT-PTD 32倍的转运蛋白质进入细胞内的效率。同时现有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制备方法并不成熟和完善，融合基因的构建、蛋白的分离及纯化工艺过程复杂，尤其是诱导融合蛋白大量表达的条件众说纷纭，并没有摸索清楚。 

发明内容

本发明的主要目的是提供一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，利用PTD4的高穿膜功能和低细胞毒性将原本不能通过细胞膜的Cu，Zn-SOD转导至细胞膜发挥生物学功能，解决现有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白存在的转导效率相对低下以及潜在的细胞毒性问题。 

本发明的另一个目的是提供所述新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，解决现有的PTD-Cu，Zn-SOD融合蛋白制备方法融合基因的构建、蛋白的分离和纯化工艺过程复杂以及诱导融合蛋白表达量少的缺陷。 

本发明构建PTD4-Cu，Zn-SOD重组基因，该重组基因由PTD4基因、Cu，Zn-SOD基因设计合成。 

PTD4基因序列如SEQID NO：1所示，具体序列如下： 

tatgcgcgtg cggcagcgcg tcaggctcgt gcc                                   33 

Cu，Zn-SOD基因序列如SEQID NO：2所示，具体序列如下： 

atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgatggcc cagtgcaggg catcatcaat      60 

ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact      120 

gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacagcagg ctgtaccagt      180 

gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg      240 

catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt      300 

gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc      360 

catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac      420