[发明专利]新型PTD4-Cu,Zn-SOD融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的基因具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括有以下步骤：

1)分别设计Cu，Zn-SOD特异性引物和PTD4寡核苷酸序列；

2)通过PCR反应扩增Cu，Zn-SOD cDNA片段；

3)PCR反应产物和pET16b载体分别经双酶切、胶回收后进行连接反应；

4)连接产物转化到DH10B大肠杆菌并提取质粒，经酶切、测序鉴定命名为pET16b-Cu，Zn-SOD质粒；

5)将PTD4两条寡核苷酸链煮沸复性；

6)分别双酶切pET16b-Cu，Zn-SOD质粒和煮沸复性的PTD4两条寡核苷酸链，胶回收后进行连接反应，连接产物转化到DH10B大肠杆菌并提取质粒，经酶切、测序鉴定命名为pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD质粒；

7)将pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)大肠杆菌中，然后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行摇床振荡培养，诱导PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白表达；

8)取经溶菌酶加超声裂解法处理诱导表达后菌体的上清溶液，利用Ni-NTA亲和层析柱在天然条件下，依次加入咪唑结合缓冲液、咪唑漂洗缓冲液缓和咪唑洗脱缓冲液，纯化PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白。

3.如权利要求2所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述Cu，Zn-SOD特异性引物包括如SEQ ID NO：4所示的上游引物以及如SEQ ID NO：5所示的下游引物，其中上游引物5′端加有Xho I限制性内切酶位点，下游引物5′端加有BamH I限制性内切酶切位点，且含终止密码子TTA。

4.如权利要求2所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，其特征在于，所述PTD4寡核苷酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的正链以及如SEQ ID NO：7所示的负链，其中正链的5′端加有Nde I限制性内切酶位点，且含起始密码子ATG，负链的5′端加有Xho I限制性内切酶位点。

5.如权利要求3所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述经PCR反应扩增的Cu，Zn-SOD cDNA片段和pET16b载体分别经Xho I和BamH I限制性内切酶切位点进行双酶切。

6.如权利要求4所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述pET16b-Cu，Zn-SOD质粒和煮沸复性的PTD4两条寡核苷酸链分别经Nde I和Xho I两个限制性内切酶位点进行双酶切。

7.如权利要求5或6所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达时，摇床震荡频率为160-220rpm/min、温度20-37℃，IPTG终浓度为0.2-1.0mM，诱导时间1-6小时。

8.如权利要求7所述的一种新型PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述结合缓冲液咪唑浓度为10mM，漂洗缓冲液咪唑浓度为20mM，洗脱缓冲液咪唑浓度为50-500mM。