[发明专利]转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及转Bt基因抗虫水稻克螟稻(KMD)转化体特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

以转基因植物的DNA为目标的检测通常利用聚合酶链式反应(PCR)有针对性的扩增目的DNA片段。聚合酶链式反应(PCR)是在体外，利用taq酶、引物、dNTP等条件，将特定DNA片断短时间内进行指数级扩增的一种分子生物方法。根据外源插入序列准确的设计引物是定性PCR检测的基础。针对具体的转化事件进行检测，插入序列以及插入序列3’端、5’端植物基因组序列需要准确的获得，并依此设计特异性引物进行检测。针对转基因中插入基因的检测，主要通过对插入的外源基因进行筛选检测以及构建特异性检测获得结果。定性检测结果分析主要对常规PCR方法扩增出来的DNA片段进行分析判断。将反应产的PCR产物经过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用溴化乙锭或其他DNA染色剂染色后进行分析。在样品进行反应的同时进行内标基因、阴性样品、阳性样品的扩增，通过这些对照来确认反应结果的可信性。为了避免假阳性反应的影响，更为准确的确定片段是否是目的片段，可以对获得的目的片段使用限制性内切酶进行酶切分析，并对酶切后的片段大小进行电泳分析，也可直接对扩增片段测序，将测序获得的序列信息与已知序列进行blast比对分析。通过酶切电泳分析或者序列测定分析，酶切片段大小符合预期或者测序结果比对与目的片段相同可以准确的确定样品结果。采用PCR方法，应根据检测对象的性质选择一种合适的DNA提取方法，高质量的提取待测样品的DNA。定性PCR方法要求引物对目的转基因DNA片段具有良好的扩增灵敏度和扩增特异性。最佳引物在合适的反应条件下可以在不到40个PCR循环反应下检测到含有转基因成分的1-10拷贝样品。所以反应引物对反应的成功至关重要，引物的特异性可以通过将该引物与核酸序列数据库中的序列进行blast相似性比对分析；反应中使用到的引物组合需要对反应的温度、反应体系等条件，通过实际实验进行优化。

有效的检测转基因成分是依照法规进行转基因监管工作的基础。为了满足转基因标识制度所提出的要求，需要转基因检测具有良好的准确性和灵敏性，越来越多的分子生物学检测技术被研究出来并成功的应用到转基因检测工作中去。根据转基因作物培育的原理，转基因作物与传统的作物的区别在于转基因作物中含有于该作物基因组不同的外源的DNA片段，并且以该DNA为模板表达了对应的功能蛋白。所以现在转基因检测方法主要是从核酸水平上和蛋白质水平上去定性定量检测转基因成分。

经过对现有专利、文献的检索，发现已有转Bt基因抗虫水稻克螟稻(KMD)筛选特异性(NOS基因)和基因特异性(Bt基因)实时荧光PCR检测方法，但筛选特异性和基因特异性是针对转基因农作物中调控元件和目的基因进行检测，由于不同农作物中可导入相同的调控元件或目的基因，因而筛选特异性和基因特异性不具有辨别所检基因是否来源于克螟稻的能力，而转化体特异性是检测外源基因在受体基因组的插入位点，由于该位点具有唯一特异性，其能够区分相同转化载体的不同转化事件，因而具有最高的特异性。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用，克服了现有检测方法特异性不够强的缺点。

本发明采取的技术方案为：

转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物，正向、反向引物序列分别为：

KMD-qF:5'-GTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCA-3'

KMD-qR:5'-GATGCGCGCTCCAACTG-3'；如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示。

转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性探针，序列为：

KMD-qP:5'-FAM-ATGGGCAGGCATATCGGCGTACG-TAMRA-3'，如SEQ ID No.3所示。

所述的转Bt基因抗虫水稻(KMD)的转化体特异性引物与探针在实时荧光PCR检测中的应用。

核酸染料实时荧光PCR检测农作物及其相关产品是否含有转基因水稻克螟稻(KMD)中的方法，步骤如下：

(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用KMD-qF/KMD-qR引物组合进行SYBR Green I实时荧光PCR扩增，扩增产物大小为104bp；