[发明专利]转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用

权利要求书

1.转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物，其特征是，正向、反向引物序列分别为：

KMD-qF:5'-GTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCA-3'

KMD-qR:5'-GATGCGCGCTCCAACTG-3'。

2.权利要求1所述的转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物在实时荧光PCR检测中的应用。

3.核酸染料实时荧光PCR检测农作物及其相关产品是否含有转基因水稻克螟稻中的方法，其特征是，步骤如下：

(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用KMD-qF/KMD-qR引物组合进行SYBR Green I实时荧光PCR扩增，扩增产物大小为104bp；

(2)实时荧光PCR扩增结束后，以PCR刚好进入指数扩增期来设定荧光信号阈值，该阈值用于定义检测样本的阈值循环数即Ct值，是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，如果检测到的荧光信号超过设定阈值即认为是阳性信号，此检测中，若克螟稻特异性序列出现典型扩增曲线且Ct值小于等于36，表明检测样品含有转基因水稻克螟稻；若不存在典型扩增曲线，表明检测样品中不含转基因水稻克螟稻。

4.根据权利要求3所述的核酸染料实时荧光PCR检测农作物及其相关产品是否含有转基因水稻克螟稻的方法，其特征是，步骤(1)所述的PCR扩增为：扩增反应体积为20μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL，浓度为10μmol L^-1的正向引物0.4μL，浓度为10μmol L^-1的反向引物0.4μL，ddH₂O8.2μL，DNA模板1μL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。

5.转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物与探针，其特征是，序列为：

KMD-qF:5'-GTCTAAGCGTCAATTTGTTTACACCA-3'

KMD-qR:5'-GATGCGCGCTCCAACTG-3'；

KMD-qP:5'-FAM-ATGGGCAGGCATATCGGCGTACG-TAMRA-3'。

6.权利要求5所述的转Bt基因抗虫水稻的转化体特异性引物与探针在实时荧光PCR检测中的应用。

7.Taqman探针法定性检测农作物及其相关产品是否含有转基因水稻克螟稻中的方法，其特征是，步骤如下：

(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用KMD-qF/KMD-qR/KMD-qP引物与探针组合进行Taqman探针实时荧光PCR扩增，扩增产物大小为104bp；

(2)实时荧光PCR扩增结束后，以PCR刚好进入指数扩增期来设定荧光信号阈值，该阈值用于定义检测样本的阈值循环数即Ct值，是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，如果检测到的荧光信号超过设定阈值即认为是阳性信号，此检测中，若克螟稻特异性序列出现典型扩增曲线且Ct值小于等于36，表明检测样品含有转基因水稻克螟稻；若不存在典型扩增曲线，表明检测样品中不含转基因水稻克螟稻。

8.根据权利要求7所述的Taqman探针法定性检测农作物及其相关产品是否含有转基因水稻克螟稻中的方法，其特征是，步骤(1)所述的PCR扩增为：扩增反应体积为20μL，2×PremixEx Taq(TaKaRa)10μL，浓度为10μmol L^-1的正向引物0.4μL，浓度为10μmol L^-1的反向引物0.4μL，浓度为10μmol L^-1的探针0.8μL，背景校准液0.4μL，ddH₂O6μL，DNA模板1μL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。