[发明专利]利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及阿苯达唑及其代谢物的含量的测定方法，尤其涉及一种利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱(UFLC-MS/MS)测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物的含量的方法。 

背景技术

中国是蚕桑的原产地，具有5 000多年的历史，素有“东方丝国”的美称。蚕丝及其丝绸制品是我国主要的出口创汇产品，其产销量约占世界总量的70%，是我国唯一可垄断世界贸易市场的出口商品。 

蚕种生产是蚕桑产业的基础。家蚕微粒子病是对蚕种生产具毁灭性的传染性疫病，因其具有胚种传染能力成为了世界产丝国的检疫对象。近二十余年来，家蚕微粒子病在我国呈全国流行趋势，淘汰超毒蚕种量达数百万张，经济损失惨重。药物治疗是目前家蚕微粒子病的最有效的防治手段之一。在家蚕微粒子病的药物治疗方面，国内学者开展了大量研究，其中在生产上大面积推广应用的是我所研制的多菌灵粉。为了获得更高效、低毒的家蚕微粒子病治疗药物材料，我们经筛选获得了治疗效果理想的药物材料阿苯达唑（也称丙硫苯咪唑）。 

阿苯达唑（albendazole，ABZ）是苯并咪唑类药物中驱虫谱较广，杀虫作用最强的一种驱虫高效低毒药物，已被广泛应用于人体医学、畜禽养殖、水产养殖等多个领域。其在体内代谢为亚砜类或砜类后，抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗竭，或抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP产生，使寄生虫无法存活和繁殖。阿苯达唑在体内迅速代谢为阿苯达唑亚砜（albendazole sulphoxide，ABZSO），其为主要代谢产物，也是药效的主要活性成分；进而转化为阿苯达唑砜（albendazole sulphone，ABZSO₂），最终生成阿苯达唑-2-氨基砜（albendazole amino sulphone，ABZSO₂-NH₂）。早在20世纪80年代初，国外已有对不同生物材料中阿苯达唑及其代谢物残留量测定方法的研究报道，Alvinerie和Galtier（1984）利用正向高效液相色谱实现了绵羊血浆中阿苯达唑及其两种代谢物的同时测定，但其未能检测到ABZSO₂-NH₂，且使用的UV检测器灵敏度较低，仅达十万分之一级别。同样利用高效液相色谱，Lanchote等（1998）仅对ABZSO及其对应体和ABZSO₂做了检测，所采用地荧光检测器的灵敏度比前者高了一个数量级。到了21世纪初，国内外在人体医学、畜禽养殖、水产养殖等多领域对各种生物组织材料中丙硫咪唑或苯并咪唑类物质测定方法的研究报道也逐渐丰富起来。如免疫分析法、毛细管电泳法、气-质联用法，液-质联用法等。Prochazkova等（2000）利用非水性的毛细管电泳法和普通的HPLC两种方法对比测定人体血液中的阿苯达唑含量，发现二者的检测效果相当。Kitzman等（2002）利用C18固相萃取柱对含阿苯达唑的人体血样在HPLC上机前进行萃取，能有效祛除杂质、排除干扰。Mottier等（2003）也利用固相萃取柱、反向HPLC技术同时对绵羊、牛等绦虫寄主体内的苯并咪唑类药物含量进行了测定。Batzias和Delis（2004）利用反向液相色谱，荧光检测器实现了对绵羊血浆阿苯达唑代谢物含量准确测定。高效液相色谱法虽然应用较为广泛，但也存在明显不足，样品处理过程比较繁琐，耗时长，易受杂质干扰。最近几年，随着现代色谱技术的快速发展，国内外陆续报道了利用超高效液相、质谱以及超快速液相色谱-质谱联用技术等测定生物组织中农药残留的研究，很大程度地使得该方法在生物材料农药含量的测定上发挥了其针对性强，灵敏度高和检测速率快的优越性。然而，相对于人或畜禽动物而言，家蚕体积较小，血淋巴采样相对困难，而且取样量受限制、药物浓度低，加上无机盐、脂质、蛋白质、自身代谢物等内源性物质干扰，对家蚕组织材料的检测提出更高要求，以上方法均不适用于家蚕组织中药物的检测。目前，尚未见针对家蚕血淋巴中阿苯达唑及其代谢物含量同时进行准确定性、定量研究的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱(UFLC-MS/MS)测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物的含量的方法，该方法可以对家蚕血淋巴中阿苯达唑及其代谢物进行同时快速定性、定量测定。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱(UFLC-MS/MS)测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物的含量的方法，包括以下步骤： 

(1) 取家蚕血淋巴进行提取，获得供试样品溶液；