[发明专利]一种提高谷氨酰胺转胺酶比酶活的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高谷氨酰胺转胺酶比酶活的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

微生物谷氨酰胺转胺酶（蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase，EC2.3.2.13简称MTG）能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与赖氨酸ε-酰基或其他酰基反应，形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键。特殊的催化能力使TGase广泛应用于食品工程、纺织与皮革加工、材料工程、生物医药等领域。但由于MTG异源表达分泌量低等缺陷，限制了MTG的应用范围。

TGase特殊的催化能力使其在工业生产中具有广泛应用，但其催化活性低、热稳定性较差，严重制约TGase作为优良催化剂在工业中的应用。除TGase酶外，许多重要的工业用酶都存在类似缺陷。酶作为重要生物催化剂，在生物体内具有高效和高特异性的特点，但在工业生产应用中，需要面对不同反应温度、pH、反应溶剂及非天然底物等问题，往往不能实现其正常催化能力。目前虽然在自然界中发现了一些嗜热酶，但数量较少，远不能满足工业需求。因此，为提高酶作为优良催化剂在工业中的应用范围，有必要对工业用酶的酶学性质进行分子改造。

前导肽C端虽非TGase必需区域，但可影响TGase分泌和催化活性。目前TGase的改造限于成熟酶分子内部，忽略了前导肽对TGase催化性能的影响。实验室前期研究发现，共表达TGase前导肽和成熟酶可以实现TGase在E.coli中的活性表达，但TGase不能够分泌到胞外。共表达结果表明，前导肽和成熟酶之间的共价连接对TGase折叠没有影响，但是促进TGase分泌的必要条件。在不影响前导肽和成熟酶共价相连前提下，选取前导肽C端为改造区域。本发明选取不同短肽插入到前导肽C端，以期望提高TGase的比酶活。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种提高谷氨酰胺转胺酶比酶活的方法，是在吸水链霉菌谷氨酰胺转胺酶前导肽和成熟酶之间插入短肽，编码所述短肽的核苷酸序列如以下（a）或（b）或（c）所示：

（a）SEQ ID NO.1；

（b）SEQ ID NO.2；

（c）SEQ ID NO.3。

所述短肽是来源于谷氨酰胺转胺酶成熟酶内部对TGase催化活性具有重要作用的loop或催化活性中心附近的氨基酸序列；所述短肽的氨基酸序列如以下（d）或（e）或（f）所示：

（d）SEQ ID NO.16；

（e）SEQ ID NO.17；

（f）SEQ ID NO.18。

所述提高谷氨酰胺转胺酶比酶活的方法，是通过定点突变技术将短肽插入到谷氨酰胺转胺酶前导肽和成熟酶之间。包括以下步骤：以含有编码吸水链霉菌pro-TGase的基因的质粒为模板，利用定点突变技术，将短肽插入谷氨酰胺转胺酶前导肽和成熟酶之间，将含有突变体基因的表达载体测序验证后，转化表达宿主E.coli BL21。

插入SEQ ID NO.1所示序列时，所用引物为Pro-(58-66)-F：

5’-GACGCTGCCGACGAGAGGGTGACCCCTCTCTTCCGGGCCCCCGACGCTG-3’；

Pro-52-R：5’-CGCACTGACGCTCGGCGGCAATTC-3’。

插入SEQ ID NO.2所示序列时，所用引物为Pro-(301-309)-F：

5’-AGTCCCGCCCGACCTGGCGAAAGTTGGCTCTTCCGGGCCCCCGACGCTG-3’；

Pro-52-R：5’-CGCACTGACGCTCGGCGGCAATTC-3’。

插入SEQ ID NO.3所示序列时，所用引物为Pro-(11-19)-F：

5’-TCCTACGCCGAAACGCACGGTCTGACGCTCTTCCGGGCCCCCGACGCTG-3’；

Pro-52-R：5’-CGCACTGACGCTCGGCGGCAATTC-3’。