[发明专利]三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记及SNP分子标记基因分型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及三疣梭子蟹C-型凝集素基因组及其抗溶藻弧菌相关的SNP分子标记的制备，以及快速进行SNP基因分型的方法，属于水产生物技术中的分子标记育种技术领域。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是大陆沿海各省海水养殖的主导产品，尤其是浙江。我国养殖的梭子蟹有三分之二是在浙江，在“十二五规划”中，三疣梭子蟹被列为宁波水产养殖三大主导产品之一。然而，近年来，由于养殖规模的不断扩大、养殖环境的污染等损害了三疣梭子蟹免疫防御系统，导致自身的抗病力下降，对病害的易感性增加，疾病频繁发生。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的感染给三疣梭子蟹养殖业带来了重大经济损失，严重制约了梭子蟹养殖业的持续健康发展。

目前，养殖户多用抗生素进行病害的防治，但从使用抗生素等药物的安全性、抗药性以及对水环境的不良影响等方面考虑，研究三疣梭子蟹的免疫机制，筛选与抗病相关的分子标记用来人工辅助育种，培育优良的抗病品系，显得越来越重要。三疣梭子蟹属于甲壳类动物，无特异性免疫应答，非特异性免疫包括细胞免疫和体液免疫，C-型凝集素是甲壳类动物体液免疫中重要的免疫因子之一。其表面携带有特异性糖基决定簇的受体，能依据颗粒物质表面的糖基组成来区分异己，它的作用类似于脊椎动物的抗体，选择性凝集外来病原菌和复杂的碳水化合物，调理和介导血细胞吞噬外来物质，协同其他免疫因子抵御外来病原入侵。

目前国内外对三疣梭子蟹的免疫相关基因的研究尚处于初级阶段，仅是得到了基因cDNA的全长及其分子结构特征以及病原刺激后该基因的表达特征等，初步阐明了该基因在机体抗感染中的积极应答。但其多态性与三疣梭子蟹抗病性状的关系研究还未见报道。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)标记是指基因组序列单个核苷酸差异而引起的遗传多态性，包括单个碱基的转换、颠换以及单个碱基的插入、缺失等。它作为一类遗传标记以其位点丰富、具有代表性、遗传稳定性高及易实现分析的自动化等特性得以广泛应用。

高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting，HRM)技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。该方法与其他遗传分型技术相比，不受突变碱基位点与类型的局限，操作简便，具有灵敏性、特异性高、成本低廉、快速、高通量检测的优点，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。HRM技术主要是根据核酸分子熔解温度和熔解形状的不同来区分样品，在PCR反应时引入饱和的荧光染料EvaGreen或LC Green plus，荧光染料在PCR扩增的过程中被嵌入到DNA双链中。当嵌有染料的DNA分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA分子的熔解曲线，不同的样品由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度(Tm值)。如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而能够成功的筛选出突变基因或进行基因分型。

因为HRM技术具有较多的优点，被广泛应用于医学分子分型诊断及甲基化研究中，近年来，也被逐步用于水产生物技术及分子育种领域中，但目前尚未有将HRM技术用于三疣梭子蟹SNP分子标记基因分型的报道。

发明内容

针对现有技术中有关三疣梭子蟹分子标记研究的不足，申请人深入开展了三疣梭子蟹C-型凝集素基因的多态性及抗病相关SNP的筛选，并将HRM技术应用于抗病相关的SNP分子标记基因分型的研究，本发明的研究成果可用于利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体作为亲本，为培育三疣梭子蟹抗病品系奠定重要的基础。

基于上述研究，本发明的第一个目的是获得三疣梭子蟹C-型凝集素基因组DNA及其多态性，并筛选出抗病相关的分子标记，为培育三疣梭子蟹抗病品系提供基因标记。

本发明的第二个目的是建立快速检测抗病相关SNP的高分辨率溶解曲线(HRM)的方法，为利用标记辅助选择(MAS)进行选择抗病基因型个体作为亲本培育三疣梭子蟹抗病品系奠定基础。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明公开了三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记(SNP)，该基因多态性标记包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4个SNP位点及一个三碱基的缺失，其中第四外显子205bp处的SNP与三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相关联，命名为T/C E4-205。