[发明专利]三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记及SNP分子标记基因分型的方法

权利要求书

1.三疣梭子蟹C-型凝集素基因多态性标记，其特征在于该基因多态性标记包括三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列的4个SNP位点及一个三碱基的缺失，其中第四外显子205bp处的SNP与三疣梭子蟹溶藻弧菌易感性/抗性相关联，命名为T/C E4-205。

2.用于得到三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相关的C-型凝集素分子标记的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)克隆三疣梭子蟹C-型凝集素基因序列；(2)制备三疣梭子蟹的抗病群体和敏感群体；(3)筛选抗病相关C-型凝集素基因标记。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)提取三疣梭子蟹血液样品中的总基因组DNA，设计引物，利用长片段PCR扩增基因组DNA获得序列，克隆至T载体后测序，获得全长的C-型凝集素基因组，该序列为序列表序列1。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于扩增引物为F1、R1，序列为F1：5’TCCTGTTCTGACAACCACCAA3’；R1：5’CTGTGCCCGAGTCAAGAAGTA3’。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)采用溶藻弧菌对三疣梭子蟹进行浸泡感染，根据死亡时间判断梭子蟹对病原菌感染的抵抗能力，将梭子蟹分为抗病群体和敏感群体。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)对步骤(2)所得个体的克隆进行测序，得到四个SNP位点：分别位于第二内含子、第三内含子、第三内含子、第四外显子；对包含SNP位点序列设计引物扩增测序，并对各基因型及等位基因做相关性分析，将第四外显子205bp处CC作为疾病敏感相关的C-型凝集素基因标记，将第四外显子205bp处TT作为抗病相关的C-型凝集素基因标记。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于扩增SNP位点的引物分别为F2，R2；F3，R3；F4，R4，序列为F2：5’TCAAATCATTTCCTTGTGAGGG3’，R2：5’ACAAAAGGATGTCACCGTAGAA3’；F3：5’GCAATTCTACGGTGACATCCTT3’，R3：5’TTATCGCCATAGTTAGCCCAAA3’；F4：5’ACTCCTTTTTGGGCTAACTATGGC3’，R4：5’TCCAAAGTAAGCTGGTTAGCACAT3’。

8.用于三疣梭子蟹抗溶藻弧菌相关联的SNP基因分型的方法，其特征在于基于高分辨率熔解曲线分析技术的PCR-HRM快速进行，具体包括下述步骤：(1)提取三疣梭子蟹血液样品中的基因组DNA，全部样品统一为一个浓度；(2)供试样品模板DNA进行PCR扩增，引物F5和R序列为F5：5’AAATGCCTACTGGAGGAGAGAAACA3’，R5：5’TTTCCTCGTTACTTCTCACAAATCG3’；(3)采用荧光定量PCR仪进行PCR扩增，并进行HRM分析，同时监测每一步的荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线；(4)分析HRM结果，比较已知基因型样品和待测基因型样品的标准视图和差异视图，对待测样品进行SNP分型。

9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述步骤(3)PCR扩增程序为98℃预变性2min，40个扩增循环(98℃5sec，58℃20s)，HRM分析方法为温度从65℃逐渐升高至85℃，每次升温0.1℃，同时监测每一步的荧光信号获得不同型别的DNA双链的熔解曲线。

10.权利要求8的方法在选择三疣梭子蟹抗病基因型个体作为亲本培育三疣梭子蟹抗病品系中的应用。