[发明专利]人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法

说明书

技术领域：

本发明涉及再生医学和生物技术领域，具体涉及脐带血中富血小板血清的综合利用和自体间充质干细胞无动物源生产体系。

背景技术：

在中国，干细胞生命银行的发展日益为广大育龄家庭所关注，多数孕妇选择为孩子储存脐带血的同时，也会选择将脐带干细胞进行培养并保存。目前的细胞库制备过程均采用小牛或者胎牛血清进行培养、消化、冻存等过程，因此，在未来的临床脐带干细胞应用中的确会存在异种蛋白的残留风险。

间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，体外贴壁呈成纤维样细胞，可以分化为骨、软骨和脂肪细胞，可以分泌大量具有免疫调节、造血支持、促进血管生成、趋化组织损伤修复等生物活性的细胞因子和生长因子。

间充质干细胞（MSCs）是来源于中胚层的有多项分化能力的干细胞，虽然以骨髓中含量较多，但是研究表明，在人的其他组织和器官中都有存在，如成人的外周血、脂肪、皮肤、脐血、脐带、甚至胎盘绒毛和羊水中也都存在，特别是脐带、胎盘和脂肪中存在大量优质的MSCs。骨髓、脐带和脂肪组织中，脂肪和脐带中含有最多的MSCs，而脐带中MSCs的扩增能力最强，三个来源的MSCs在形态学和免疫源性方面没有区别且三者都可分化成骨和软骨（Kern等，2006）。在旁分泌功能上，脐带MSCs远远好于骨髓MSCs，脐带MSCs分泌的多种生长因子是骨髓MSCs的一千倍以上（Friedman等，2007）。其在发育阶段与胚胎干细胞接近，又具备多能干细胞的许多生物学特征，使用不需配型，数量丰富，分化能力强，可定向分化为血管干细胞、上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞等多种干细胞，同时不产生肿瘤，没有伦理学问题。

由此分析，研究采用生育来源的MSCs应具有更广阔应用前景和更优的治疗效果。其优势在于：本身是生育废弃物，来源充足，容易获得；细胞年龄轻、分化能力强，未有其他成人干细胞受到环境、辐射等侵害，品质纯净；干细胞旁分泌功能强大，因此对机体发挥的营养调节和免疫调节作用比其他成体干细胞更强。

MSCs的培养、扩增、储存等过程目前文献报道主要是采用胎牛血清的方法(Sarugaser等2005； Sotiropoulou等2006)。采用胎牛血清5~-20%可以容易地获得的脐带间充质干细胞并且扩增数量大，生产也较易进行商品化控制（Friedman 等2007）。MSCs  存在于多种成体组织内，目前可以从脐带、胎盘、成人骨髓、外周血、脂肪等组织中分离获得。然而，在这些已知来源中，MSCs  含量平均为 1/10⁸ ~ 1/10³。通常临床细胞治疗所需要的 MSCs  数量为 10⁶ ~ 10⁹个，为了获得足够数量的 MSCs，需要对分离获得的 MSCs 进行体外培养和传代扩增。常用的含动物血清（FBS或FCS）培养基可以在17 ~ 30天内扩增 MSCs以满足应用的需要。但是采用动物血清存在着两种风险，第一是异源性动物源蛋白残留对治疗机体产生的过敏污染反应，二是潜在的动物源已知或未知的病毒、支原体等病原体污染。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术不足，解决未来临床应用的需要，提供一种无动物血清、无异体蛋白的自体脐带间充质干细胞培养方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其步骤为：脐带血富血小板血清的制备，血小板裂解液的制备，去血小板血清的制备，血小板裂解液中的细胞因子PDGF-AB，FGF2, TGF-β，VEGF含量的确定，脐带干细胞的分离和原代培养，脐带干细胞的培养及传代，脐带干细胞冻存，染色体核型分析,培养后脐带间充质干细胞的特征分析。

所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，所述的脐带血富血小板血清的制备：采集的脐带血50~120ml分装在50ml无菌离心管中，在4~30度温度下， 150~220g离心5~25分钟，上层为富含血小板血清，采血袋或采血管中采用2000~5000UI的肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的40%。