[发明专利]人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法

权利要求书

1.一种人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：其步骤为：脐带血富血小板血清的制备，血小板裂解液的制备，去血小板血清的制备，血小板裂解液中的细胞因子PDGF-AB，FGF2, TGF-β，VEGF含量的确定，脐带干细胞的分离和原代培养，脐带干细胞的培养及传代，脐带干细胞冻存，染色体核型分析，培养后脐带间充质干细胞的特征分析。

2.根据权利要求1所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的脐带血富血小板血清的制备：采集的脐带血50~120ml分装在50ml无菌离心管中，在4~30度温度下， 150~220g离心5~25分钟，上层为富含血小板血清，采血袋或采血管中采用2000~5000UI的肝素作抗凝剂，上层的血清占总体积的40%。

3.根据权利要求1或2所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的血小板裂解液的制备：将富血小板血清移至新的无菌离心管中，采用Sysmex hematology analyzer (KX-21)对全血和血清中所含红细胞、白细胞、血小板数量进行计数，脐带间充质干细胞培养用血清中理想的血小板的数量在0.5~1×10⁹/ml之间；将血清置于-80度冰箱冻存2~24小时；冻存后的含血小板血清在37度快速复苏后，经800~1200g离心5~30分钟，去除细胞碎片，上清液即为血小板裂解液，用于自体脐带干细胞的培养。

4.根据权利要求1或2或3所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的去血小板血清的制备：脐带血离心分离获得上层富血小板血清的过程后，对留在离心管中的中层有核细胞和下层红细胞以800g~1000g速度离心30~40分钟，上层清亮的血清层即为去血小板血清。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的血小板裂解液中的细胞因子PDGF-AB，FGF2, TGF-β，VEGF含量的确定：采用R&D系统的酶联免疫（ELISA）试剂盒进行检测。

6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的脐带干细胞的分离和原代培养：足月胎儿脐带取15~20cm长，经过生理盐水和75%酒精清洗后，剪成小段，分别将动脉和静脉剥离，将中间的华通氏胶分离出来，在无菌条件下解剖成0.2~2mm小组织块，直接在细胞培养瓶中培养；或经过0.1%~0.2% 37度下胶原酶消化1小时，获得单细胞悬液，计数调节细胞浓度，然后接种于无菌培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养；采用基础培养基DMEM加自体血小板裂解液进行培养，裂解液的添加比例根据原始的血小板数量而定，一般在5%~20%之间。

7.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的脐带干细胞的培养及传代：原代培养每3~5天换液一次，当脐带间充质干细胞生长融合度达到80%时，将细胞培养液收集，200g离心后，上清液备用；培养瓶中的细胞经过无钙镁离子的无菌PBS冲洗两次，用0.25%胰酶37度消化2~3分钟，待细胞呈现圆形并逐步脱离培养瓶底部后，将上述备用细胞培养上清液倒入消化的培养瓶中，终止胰酶反应；用移液管轻轻吹打消化后的脐带干细胞并收集，200g离心5分钟，将收集的细胞重新接种到新的培养瓶中进行扩增，直至达到预期的细胞数量。

8.根据权利要求1或2或3或4或5或6或7所述的人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法，其特征是：所述的脐带干细胞冻存：冻存液的主要成分包括基础培养基5~10%的DMSO以及去自体血小板血清；采用胰酶消化办法，将脐带间充质干细胞从培养瓶中消化下来，以10⁶个干细胞/ml浓度悬浮于上述冻存液中并将细胞悬液放置在2.0ml冻存管中，冻存管在异丙醇为介质的程序冻存盒中逐渐降温到-80度，然后置于-150度液氮气相环境中长期保存。