[发明专利]生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种用于生产丁二酸的重组质粒和一种高产丁二酸的基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌的构建方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备发酵生物质生产丁二酸的生物产品中的用途。

背景技术

能源和环保是当今世界面临的重要问题。丁二酸作为一种生物基化学品，是最好的石油替代品之一。

丁二酸(IUPAC succinic acid，中文又名琥珀酸)是一种四碳二羧酸，化学式为HOOC-CH₂-CH₂-COOH。主要作为有机合成的原料，生产如丁二酸酐、丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等化工产品；随着催化工艺的发展，丁二酸还可转化为醇酸树脂、油漆、食品调味剂等精细化工产品和医药产品如磺胺药、维生素A、维生素B、抗痉挛剂等。目前全世界市场需求超过2.76×10⁵t/a，且以每年6％-10％的速度增长。

目前，大部分工业用丁二酸是以石油为原料通过化学方法来合成，如丁烯二酸催化加氢、氯乙酸甲酯的氰化水解以及石蜡氧化法等，c成本高，且造成环境污染。随着人们可持续发展意识和环保意识的提高，发酵法生产丁二酸进入了人们的视线，引起了研究热潮。一旦实现了丁二酸发酵大规模生产，便可以减少石油资源的使用和石化法带来的严重污染。丁二酸发酵消耗1mol葡萄糖的同时固定1mol CO₂，消耗了温室效应气体，因此，发酵法生产的丁二酸是一种

与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，丁二酸发酵研究起步较晚，文献报道也相对较少。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的菌种包括产丁二酸厌氧螺菌、产丁二酸放线杆菌和经基因改造的大肠杆菌。这三种菌都是通过混合酸发酵产能，发酵产物为乙酸、乳酸、丁二酸等。但是，丁二酸厌氧螺菌要求绝对厌氧环境，培养条件苛刻。并且，在低二氧化碳水平下，产丁二酸厌氧螺菌发酵葡萄糖以产乳酸为主要产物，而产丁二酸放线杆菌则发酵葡萄糖以产乙醇为主要产物；只有在高CO₂浓度的条件下进行发酵才以丁二酸为主要产物，这就需要额外的供气设备，增加产品成本。相比而言，大肠杆菌培养条件简单，菌株本身有多条产丁二酸途径，具有代谢灵活，易于改造的特性。对大肠杆菌丁二酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸发酵中，丁二酸生成是通过三羧酸循环的还原臂生成的，由该途径产生1mol的丁二酸伴随着1mol CO₂的固定。该途径的关键反应是将三碳中间物：磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化为四碳化合物草酰乙酸。草酰乙酸随后被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸(malate)，由富马酸合成酶生成富马酸，最后由富马酸裂解酶生成丁二酸。

在大肠杆菌发酵葡糖的过程中，有机酸逐渐积累，导致环境的pH值逐渐降低。为了控制细菌生长环境的pH值，需要在发酵液中添加大量的碱中和剂，目前研究的大肠杆菌工程菌发酵葡萄糖产丁二酸的过程中，用到的碱性中和剂有NaOH，Na₂CO₃，NaHCO₃，Mg(OH)₂，MgCO₃。经过研究，我们发现不同的碱性中和剂对细胞的生长和丁二酸产量有显著影响，见表1。