[发明专利]生产丁二酸的重组质粒、基因工程菌的构建及用途

权利要求书

1.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒携带完整的大肠杆菌MgtA基因的片段，即该重组质粒是携带有序列表中SEQ ID NO：2所示的DNA片段的pTrchisA载体。

2.一种琥珀酸高产、低成本基因工程菌DYCMG111，其特征在于：所述工程菌是通过将权利要求1所述的重组质粒转入起始菌DC1515中而得到的。

3.权利要求1的重组质粒的构建方法，其特征在于，(1)首先设计引物：mgtA up：-5’GGAGGGACTCCTTATGTTTAA3’-，mgtA down：-5’GCTATCGTGCCCAGTTTAT3’-；以大肠杆菌的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个长度为2820bp的片段，经测序证实其为序列表中SEQ ID NO：1的DNA片段；纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-mgtA1；(2)利用设计的引物pTrchisA-mgtA up：-5’CGATTCGGATCCCTCCTT3’-，划线处为BamHI酶切位点；pTrchisA-mgtA down：-5’CGTACCCGGAAGCTTTCTAGAGA3’-，划线处为HindIII酶切位点；以质粒pMD-mgtA1为模板，进行PCR扩增，得到一个长度为2767bp的片段，经测序证实其为序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段，含有大肠杆菌镁离子转运蛋白MgtA基因编码序列，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-mgtA2；(3)将pMD-mgtA2质粒与pTrchisA质粒分别用BamHI和HindIII双酶切，将序列表中SEQ ID NO：2的DNA片段插入质粒pTrchisA的酶切位点处，构建出所述重组质粒。

4.权利要求2的琥珀酸高产、低成本基因工程菌DYCMG111的制备方法，其特征在于，权利要求1的重组质粒转入起始菌DC1515中，得到所述基因工程菌DYCMG111。

5.权利要求1中的重组质粒或权利要求2的琥珀酸高产、低成本基因工程菌DYCMG111在制备用于基因工程发酵生产丁二酸的生物产品中的应用。

6.使用权利要求2的琥珀酸高产、低成本基因工程菌DYCMG111发酵葡萄糖生产丁二酸的方法，其特征在于：所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导剂时，在双阶段发酵生产丁二酸。