[发明专利]一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物杀菌剂的制备方法，尤其是涉及一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法。

背景技术

植物根际中存在着一些有益的细菌，它们可以通过直接或间接的方式促进植物生长并对由病原菌引起的植物病害起到防治作用，这些能够促进植物生长、防治病害并增加作物产量的微生物统称为植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)。此类根际微生物种类丰富多样，选择适当的根际促生细菌对植物进行处理(如浸种或喷雾)，可以改善根际微生态环境、促进植物生长、抑制或减轻植物病害、减少化肥和农药投入、减轻环境污染等作用。本发明提供的细菌是从植物根部分离获得，属于根际促生细菌。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供将绿针假单胞菌经过微生物培养、发酵而获得新型生物杀菌剂吩嗪-1-甲酰肼的制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将绿针假单胞菌接种到经过高温灭菌的液体培养基中并置于全自动控温摇床上，控制转速为180-240rpm，在25-30℃下培养1-3天得到含有绿针假单胞菌的液体种子；

(2)将液体种子液移入到经过高温灭菌的装在发酵罐中的培养基中，控制发酵罐转速为180-240rpm，在25-30℃下培养2-5天，即得到含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液；

(3)将含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液在搅拌下用酸调节pH至2-4，然后进行过滤，得到的滤液用溶剂进行萃取、分离、浓缩、结晶及干燥，即制备得到吩嗪-1-甲酰肼生物杀菌剂。

所述的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)是上海农乐生物制品股份有限公司通过筛选获得的一种重要的植物根际促生细菌，其保藏编号为CGMCC NO.6773；保藏时间：2012年11月2日；保藏单位：保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心China General Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

步骤(1)中所述的液体培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米粉1-5％、豆饼粉2-8％、蛋白胨1-3％、K₂HPO₄0.01-0.03％、KH₂PO₄0.01-0.03％、无水硫酸镁0.03-0.08％、甘油0.1-0.3％，余量为水，液体培养基的pH为6.5-7.5。

步骤(2)中所述的培养基的配方采用以下组分及重量百分比含量：玉米粉1-5％、豆饼粉2-8％、蛋白胨1-3％、K₂HPO₄0.01-0.03％、KH₂PO₄0.01-0.03％、无水硫酸镁0.03-0.08％、甘油0.1-0.3％，余量为水，培养基的pH为6.5-7.5。

步骤(3)中所述的酸选用盐酸、硫酸或草酸。

步骤(3)采用膜过滤、板框过滤或离心机过滤处理含有吩嗪-1-甲酰肼的发酵液。

步骤(3)中所述的溶剂为乙酸乙酯、氯仿或乙酸丁酯。

与现有技术相比，本发明采用从植物根围分离到的绿针假单胞菌大部分都具有防病增产作用，可用于植物病害的生物防治。该类菌株对黄瓜霜霉病和白粉病菌、水稻纹枯病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒疫病菌、油菜菌黑病菌、番茄灰霉病菌等多种瓜果蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用，并且能够在多种作物根际进行定殖，显示了在生物防治中应用的潜力。

绿针假单胞菌对黄瓜白粉病、辣椒疫病、甜瓜蔓枯病等农作物真菌病原菌有很强的抑制作用。绿针假单胞菌的作用机理一是产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物生长；二是菌体产生代谢物质或通过竞争作用抑制或阻碍根围病原微生物的发展，间接促进植物的生长。其生防作用机理涉及有效的根部定殖、抗生作用、根际营养竞争(特别是对Fe的竞争)、诱导植物抗性和分泌降解微生物的酶等。